鹽析法(saltingoutmethod)純化免疫球蛋白

    (一)　原理
　　蛋白質在水溶液中的溶解度是由蛋白質周圍親水基團與水形成水化膜的程度，以及蛋白質分子帶有電荷的情況決定的。當用中性鹽加入蛋白質溶液，中性鹽對水分子的親和力大于蛋白質，于是蛋白質分子周圍的水化膜層減弱乃至消失。同時，中性鹽加入蛋白質溶液后，由于離子強度發生改變，蛋白質表面電荷大量被中和，更加導致蛋白溶解度降低，使蛋白質分子之間聚集而沉淀。
　　(二)　主要材料
　　1.　試劑:
　　(1)　正常人混合血清；滅菌生理鹽水。
　　(2)　飽和硫酸銨溶液的配制:
　　稱 (NH4)2SO4(AR)400～425克，以50～80℃之蒸餾水500ml溶解，攪拌20分鐘，趁熱過濾。冷卻后以濃氨水(15N　NH4OH)調 PH至7.4。配制好的飽和硫酸銨，瓶底應有結晶析出。
　　(3)　萘氏試劑配制：
　　稱HgI11.5克，KI8克，加蒸餾水至 50ml，攪拌溶解后，再加入20％NaOH 50ml。
　　(4)　0.02M, PH7.4磷酸鹽緩沖鹽液 (Phosphate Buffered Saline PBS)配制:
　　貯存液:
　　A 液：0.2M Na2HPO4：Na2HPO4·12H2O 71.64克，加蒸餾水至1000ml；
　　B 液: 0.2M NaH2P4：NaH2P4·2H２O 3.12克，加蒸餾水至1000ml；
　　應用液：取A液81ml加B液19ml混合，再以生理鹽水作10倍稀釋即成。
　　(5)　0.1M, PH7.4磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer PB)配制:
　　將上述A液取81ml與B液19ml混合，再以蒸餾水對倍稀釋即成。
　　(6)　20％磺基水楊酸。
　　2.　器材:
　　普通冰箱、離心機、電磁攪拌器，751桮型紫外分光光度計、扭力天平，粗天平。
　　透析袋、尼龍繩、細竹棒、精密PH試紙 (PH5.5～9.0)、眼科鑷子、小剪刀。
　　燒杯、量筒、吸管、滴管、滅菌小瓶、試管等。
　　(三)　鹽析的操作步驟
　　　取正常人混合血清加等量生理鹽水，于攪拌下逐滴加入與
　　　稀釋血清等量的飽和硫酸銨[終濃度為50％飽和(NH4)2SO4]
　　　　　　　　　　　↓4℃，3小時以上，使其充分沉淀
　　　離心(3000rpm), 20分鐘，棄上清，以生理鹽水溶解沉淀至Xml。
　　　再逐滴加飽和硫酸銨Ｘ/２ml
　　　　　　　　　　　↓置4℃，3小時以上［此時(NH4）2SO4的飽和度為33％)］
　　　重復上述第二步過程1?次。將末次離心后所得沉淀物以0.02M
　　　PH7.4 PBS溶解至Xml裝入透析袋。
　　　　　　　　　　　│對PBS充分透析、除鹽換液3次，
　　　　　　　　　　　↓至萘氏試劑測透析外液為無黃色
　　　將透析袋內樣品取少許作適當倍數稀釋后，以751-G紫外分光光計測蛋白含量。
　　　方法如下:
　　　　　蛋白含量(mg／ml)＝ (1.45×OD280nm-0.74×OD260nm)×樣品稀釋度。
　　　　　注：式中1.45與0.74為常數，nm為波長。
　　(四)　影響鹽析的因素
　　1.　蛋白質的濃度：鹽析時，溶液中蛋白質的濃度對沉淀有雙重影響，既可影響蛋白質沉淀極限，又可影響蛋白質的共沉作用。蛋白質濃度愈高，所需鹽的飽和度極限愈低，但雜蛋白的共沉作用也隨之增加，從而影響蛋白質的純化。故常將血清以生理鹽水作對倍稀釋后再鹽析。
　　2.　離子強度:各種蛋白質的沉淀要求不同的離子強度。例如當硫酸銨飽和度不同，析出的成分就不同，飽和度為50％時，少量白蛋白及大多數擬球蛋白析出；飽和度為33％時γ球蛋白析出。
　　3.　鹽的性質：最有效的鹽是多電荷陰離子。
　　4.　PH值：一般說來，蛋白質所帶凈電荷越多，它的溶解度越大。改變PH改變蛋白質的帶電性質，也就改變了蛋白質的溶解度。
　　5.　溫度：鹽析時溫度要求并不嚴格，一般可在室溫下操作。血清蛋白于25℃時較0℃更易析出。但對溫度敏感的蛋白質，則應于低溫下鹽析。
　　6.　蛋白質沉淀后宜在4℃放3小時以上或過夜，以形成較大沉淀而易于分離。