盤點全基因組檢測CRISPR脫靶位點的幾種重要技術

　　在2013年，來自麻省總醫院的研究人員發現使用CRISPR-Cas RNA引導性核酸酶的一個重要局限：會在預期靶點以外的位點上生成多余的DNA突變。此后陸續有研究直接說明了CRISPR/Cas9存在嚴重的脫靶性，即該技術可以發生非特異性切割，引起基因組非靶向位點的突變，這樣會造成研究結果的不確定性以及研究工作的大量增加，這一問題嚴重地限制了Cas9的應用。

　　因此科學家們希望能通過全基因組檢測脫靶剪切，近年來研發了不少檢測脫靶剪切酶活性的實驗方法，比如近期Nature Methods報道的兩項技術，這些技術是什么，具有何種優勢，具體讓我們來看看：

　　1.GUIDE-seq

　　以往人們在檢測CRISPR-Cas核酸酶誘導的脫靶DNA斷裂時，往往事先假定脫靶位點與靶標位點相似。GUIDE-seq是首個不需要這樣做的方法，而且它相當靈敏 。

　　一組研究人員利用一種短雙鏈寡核苷酸來標記CRISPR-Cas誘導的脫靶斷裂，測序這些標簽所在的基因組區域，就能夠確定脫靶突變的位置。研究表明，就算某個脫靶突變的出現頻率低至0.1%，GUIDE-seq也能夠檢測得到。由于許多脫靶突變發生在與目標位點差異很大的地方，因此脫靶DSB的數量和位置是很難預測的。

　　現有工具主要是通過分析目標序列來預測脫靶突變，研究人員將這些工具與GUIDE-seq進行了比較。研究顯示，上述工具在預測已驗證的脫靶位點時比GUIDE-seq差很多，還會錯誤檢出實際上不被酶切的位點。此外，研究人員還對比了GUIDE-seq和ChIP-seq（檢測蛋白與DNA的結合），結果證明ChIP-seq并不是鑒定 CRISPR-Cas脫靶DSB的可靠方法。

　　2.Digenome-seq

　　來自韓國首爾大學、首爾基礎科學研究所等機構的研究人員在Nature旗下子刊《Nature Methods》發表一項研究，成功證實CRISPR-Cas9在人類細胞中有精確的打靶作用，他們開發出一種強大、敏感、無偏見和具有成本效益的方法——Digenome-seq，可在全基因組范圍內檢測人類細胞中的CRISPR/Cas9脫靶效應。

　　在這項研究中，研究人員稱，雖然RNA引導的、通過CRISPR-Cas9系統的基因組編輯已經被廣泛應用于生物醫學研究，但是Cas9核酸酶的全基因組靶向特異性仍然是有爭議的。為此，他們提出一種方法Digenome-seq，利用基因組測序查找CRISPR-Cas9可能突變產生的打靶和脫靶序列。他們用Cas9核酸酶在試管中消化人類基因組DNA，然后進行全基因組測序。這種體外消化可產生打靶和脫靶序列的獨特模式，可以通過計算確定。此外，個在sgRNA末端添加組成CRISPR-Cas9的鳥嘌呤核苷酸，研究人員成功地制備了這種高度發達的可編程核酸酶，在人類基因組中它沒有可測量的脫靶效應。

　　此后，這一研究組又公布了Digenome-seq升級版，并且他們用這一技術同時分析了11個CRISPR-Cas9核酸酶在整個基因組中的特異性，大大節省了CRISPR脫靶分析所需的時間和經費。

　　研究人員先將基因組DNA從人類細胞中提取出來，然后用多個sgRNA-Cas9組合進行消化，最后進行全基因組測序。他們用一種新的DNA剪切評分系統，鑒定了Cas9在基因組中的剪切模式，即打靶和脫靶位點的特性。研究表明，轉錄自雙鏈寡核苷酸的sgRNA引起了許多脫靶事件，而轉錄自質粒模板的sgRNA沒有這樣的問題。多重化Digenome-seq可以捕捉到很多被其他方法漏掉的良性脫靶位點。研究人員還在此基礎上給出了減少CRISPR-Cas9脫靶效應的指南。

　　3.基于整合酶缺陷型慢病毒載體（IDLV）的技術

　　這一技術可以針對CRISPR和TALENs兩種技術：在非同源末端連接（NHEJ）的DNA修復過程中，線性的雙鏈IDLV基因組能夠優先整合到雙鏈斷裂（DSB）中。根據之前發表的文章，這些IDLV能夠引入ZFN處理的細胞，標記DSB的位置。之后，利用線性擴增介導的PCR，可定位IDLV的整合位點，揭示IFN是否擊中目標位點。

　　受到這種方法的啟發，美國希望之城貝克曼研究所和浙江大學第一附屬醫院的研究人員將其修改后應用于CRISPR和TALENs。

　　研究人員利用表達CRISPR/Cas9核酸酶或TALENs的質粒轉染HEK細胞，之后轉導了IDLV。這個IDLV攜帶的基因賦予了抗生素和嘌呤霉素的抗性。核酸酶形成DSB后，允許IDLV整合，使得耐受嘌呤霉素的克隆數量增加了兩到三倍。

　　對于CRISPR/Cas9和TALEN處理過的細胞，研究人員在目標切割位點的60 bp內鑒定出成簇的IDLV整合位點（CLIS）。當他們尋找WAS和TAT基因以外的CLIS時，在TALEN處理的細胞中未找到脫靶位點，而在CRISPR/Cas9核酸酶中發現一些。之后他們利用芯片預測和深度測序來確定IDLV分析的靈敏度，發現它能夠檢測頻率低至1%的脫靶切割。

　　4.BLESS

　　科學家提出一種利用全基因組技術進行DNA雙鏈斷裂(DSBs)作圖新方法，這種作圖法以單核苷酸為基本單位，稱之為BLESS(direct in situ breaks labeling, enrichment on streptavidin and next-generation sequencing)。

　　研究人員利用人類和小鼠細胞以及不同的DNA雙鏈斷裂(DSBs)誘導因子和測序平臺對BLESS法進行驗證。BLESS能夠識別端粒末端、SCE核酸內切酶誘導的DNA雙鏈斷裂以及復雜的DSB全基因組。作為一種原理證明，我們讓人類細胞復制壓以敏感性基因組為特點，確定了> 2,000非均勻分布的阿非迪霉素敏感區(ASRS)，它們中基因過多，富含微衛星重復序列。人類癌癥重排區也富含ASRS，許多癌癥相關的基因對復制壓具有極高的敏感性。

　　研究人員稱，這種新方法適合各種細胞核實驗條件下DSBs全基因組作圖，其特異性和分辨率是現在的技術無法實現的。

　　5.SITE-Seq

　　研究人員研發出了一種新生化方法，通過測序（SITE-Seq方法）選擇性富集和識別標記基因組DNA末端，從而在純化的基因組DNA中找到Cas9的切割位點。SITE-Seq是一種生物化學檢測方法，因此基因組DNA可以通過一系列sgRNP濃度進行消化，從最低到最高，從而可以進行高分辨率和低切割靈敏度的脫靶位點鑒別，這樣研究人員就可以細致全面的檢查細胞中可能的脫靶位點，檢測突變頻率和功能性細胞影響。而且SITE-Seq也能創建高度富集sgRNP切割片段的測序文庫，幫助以最小的讀取深度進行特異性分析，這是將SITE-Seq作為高通量指導選擇工具的一個至關重要的特征。

　　最終，研究人員利用SITE-Seq來描繪了一組sgRNP生化切割的圖譜，檢測了靶向人類基因組的sgRNA的Cas9特異性，這些位點的數目取決于sgRNA序列和核酸酶濃度，在較低濃度下鑒定的位點顯示出細胞中脫靶突變的傾向性較高，脫靶位點列表也指出細胞內Cas9活性受到sgRNP遞送，細胞類型和暴露于核酸酶的持續時間的影響。

　　6.CIRCLE-seq

　　麻省總醫院和哈佛大學的研究人員介紹了一種新的體外篩查方法CIRCLE-seq。他們認為，這種方法在鑒定全基因組的CRISPR/Cas9脫靶突變上，比現有的細胞或生化方法表現更佳。

　　研究人員認為，這種方法可以鑒定與細胞類型特異的單核苷酸多態性相關的脫靶突變，證明了它有望生成個性化的特異性圖譜。同時CIRCLE-seq為鑒定全基因組范圍的脫靶突變提供了一種快速全面的方法。

　　研究人員也檢測了新方法的靈敏度。他們獲得了針對HBB基因的向導RNA的脫靶結果，并將這個圖譜與另一種鑒定方法（Digenome-seq）獲得的圖譜進行比較。他們發現，CIRCLE-seq鑒定出Digenome-seq所發現的29個脫靶位點中的26個，同時還發現了156個新位點。