盤點：循環腫瘤細胞（CTCs）的監測手段

　　循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）是脫落進入血液循環的腫瘤細胞，通過采集一定定量的外周血監測其在血液中含量的變化，可用于證實腫瘤的存在、發病過程、評估患者的預后、識別患者接受治療后臨床狀況的改善情況、耐藥情況等作出診斷。

　　CTCs—腫瘤轉移的種子

　　早在1889年，Paget提出了 “種子和土壤”的學說，強調癌細胞和微環境之間的關系，認為腫瘤轉移的形成，是處于旺盛生長狀態的腫瘤細胞作為“種子”，當遇到合適的器官、組織的基質環境，即“土壤”時，就會發生腫瘤的轉移。在1896年，澳大利亞學者Ashworth在一例轉移性腫瘤患者血液中首次觀察到從實體腫瘤中脫離并進入血液循環的腫瘤細胞，并率先提出了CTCs的概念。不過長時間以來CTCs的檢測并未在腫瘤患者的防治中發揮應有的作用,主要原因就是檢測技術未取得突破性進展。從上世紀末以來CTCs檢測技術得到了不斷的改進，隨之帶來的是CTCs檢測在臨床的應用。FDA于2004年批準了CellSearch系統在轉移性結直腸癌、乳腺癌和前列腺癌治療中的應用，隨著CTCs研究的不斷深入，越來越多的腫瘤治療會得益于CTCs的檢測。

　　CTCs的檢測手段有哪些

　　目前各種CTC富集技術基本上是基于以下三種原理：免疫捕獲、細胞大小、其他特征的識別（如細胞密度、電荷、形變能力等），前兩種是目前應用較多的方法。富集后對其中的CTCs進行鑒定，目前主要通過免疫熒光、H.E染色、熒光定量PCR、FISH等分子方法檢測某個或某些生物標志物而實現。由于只要把CTCs富集到，就可以根據不同目的而使用不同的生物標志物來進行鑒定，因此現階段的焦點問題還是CTCs富集的方法學問題。

　　總結起來，CTC技術主要分為以下幾種：

　　1、以CTCs表面抗原和免疫熒光為基礎的方法

　　市場上已有多種應用這種原理的檢測設備，如CellSearch系統、CTC-Chip、免疫磁性細胞分選儀(MACS)、RARE Cell、AdnaTest癌細胞檢測系統等。以CellSearch系統為例，CellSearch系統是目前惟一被FDA批準進入臨床，用于預測轉移性乳腺癌、前列腺癌和結直腸癌的CTCs檢測技術，這種技術集合了免疫磁珠分選技術和免疫細胞化學法的分離檢測技術。

　　但是，各種不同組織來源的腫瘤細胞只有70％表達EpCAM，一些腫瘤細胞由于發生了上皮間質轉化（EMT) ，上皮細胞特異性抗原丟失使得單一抗體捕獲CTCs的效率降低。因此會發生一些極端例子，比如已經全身多處腫瘤轉移的病人，由于癌表面的抗原已經脫落，反而會出現假陰性的結果。

　　2、以細胞大小差異和過濾為基礎的方法（ISET）

　　 新加坡的ClearBridge公司正是采用的這種方法， ClearCell? FX1是該公司最新研發的產品，該系統由微流體芯片（CTChip?FR）驅動。這種微流體芯片通過曲線通道中的“固有迪恩渦流”對CTC與其它血液成分的大小、形變能力和惰性進行區分從而分離出CTC，這一過程也叫迪恩流分離（DFF）。經過DFF步驟，血細胞在CTChip?FR的通道中分散分布，大細胞會沿附在內壁而小細胞則會遠離內壁。ClearCell? FX 系統因此得以高效快速地分離CTC而不會損害細胞。簡單點說，就是根據癌細胞的物理特性進行分離，保持了癌細胞的生物活性。

　　與市場上常用的CTC富集系統相比，ClearCell? FX1具有三大優勢：

　　1）準確度、敏感度更高，且無需標記。該系統利用的是癌細胞的物理特性，富集效果不受癌細胞抗原脫落的影響，與市場上同類產品相比，其靈敏度要高幾十倍，且無需標記。

　　2）富集到的CTC純度更高。7.5ml血液，通過ClearCell? FX系統分離，富集到的CTC中夾雜的白細胞約在500-2000之間，而通過抗體富集得到的CTC中，白細胞的含量約在1000-10000之間。

　　3）保持了癌細胞的生物活性。ClearCell? FX1利用的是癌細胞的物理特性，能夠保持癌細胞的生物活性，便于后續進行體外培養、動物模型建立及相關檢測，研究癌癥的生物學機理和開發新療法。

　　目前上海立聞醫學檢驗所正和新加坡的ClearBridge公司開展戰略合作，已經在臨床進行了多例驗證，效果理想，在一位腸癌患者血液中成功富集到了腫瘤細胞團（claster），并從另一位肺癌患者血液中成功富集到了CTC,移植于免疫缺陷動物體內，成功建立了動物移植瘤模型3、以DNA/RNA為基礎的檢測方法

　　CTCs的某些基因或表達的mRNA不存在于正常的血細胞中，可通過對這些DNA或RNA的檢測來判斷CTCs的存在。這種RT-PCR的方法非常靈敏，可分析極微量RNA，然而因為該技術是以信號放大為基礎的，稍有污染就容易造成假陽性的結果出現，目前，其在臨床應用中最大的限制就是，缺乏明確的特異性標志物，發現明確的腫瘤細胞特異性mRNA對于促進CTCs檢測的特異性及準確性至關重要。

　　與傳統的影像學診斷、內窺鏡檢查以及病理學診斷相比，優勢顯著，可更加敏感地發現疾病的變化，更加科學、迅速的評價某一治療方案的效果。而且分離富集CTCs只需抽取患者少量外周血，對患者沒有副作用，因此可以高頻度的監測，達到實時監測疾病進展的目的。更為重要的是，CTCs可作為分析患者腫瘤生物學特征的實時樣本，可以發現患者的實時生物學變化，并根據結果及時調整治療方案，實現實時的個體化治療。