四、連接產物的轉化
1.感受態細胞的制備
⑴ 保存于-70℃的DH5α（或其他菌種）用接種環劃菌于1.5%瓊脂平板上，37℃恒溫倒置培養至單菌落出現（約14-16 hr）。
⑵ 挑取單菌落，接種于2.0ml LB液體培養基中，37℃恒溫，250g振蕩培養過夜（約12hr）。
⑶ 取0.5ml 過夜培養液，接種于100ml LB液體培養基中，37℃振蕩培養2-2.5hr，至OD600為 0.4-0.5時，放置于4℃冰箱冷卻1-2hr。（注：以下操作均應在冰浴中進行。）
⑷ 將培養液分入兩個50ml離心管中，4℃離心，4000g×10min，棄去上清，用冰浴的0.1M MgCl2 25ml懸浮30min。
⑸ 4℃離心,4000g×10min，棄去上清，加入冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液1ml懸浮。
⑹ 以100μl/管分裝入1.5ml離心管中，-70℃凍存備用。
注：此法制備感受態細胞，可使每微克超螺旋質粒產生5×106-2×107個菌落，這樣的轉化效率足以滿足所有在質粒中進行的常規的需要，制備的感受態細胞可貯存于-70℃，但保存時間過長會使轉化效率在一定程度上受到影響，一般三個月以內轉化效率無多大改變。
2. 連接產物的轉化
⑴ 取100μl貯存于-70℃鈣化菌，冰浴化開；
⑵ 加入適量連接產物（一般不超過10μl，輕輕混勻，冰浴20min；
⑶ 于42℃熱休克90s，迅速轉移至冰浴中，繼續冰浴2-3min；
⑷ 加入LB液體培養基200μl，于37℃緩搖孵育45min；
⑸ 將培養物適量涂于1.5%瓊脂LB平板（根據質粒性質添加抗生素或/和X-Gal/IPTG），待膠表面沒有液體流動時，37℃溫箱倒置培養 12-16hr。
五、重組子的篩選
根據載體的遺傳特征篩選重組子，如α-互補、抗生素基因等。現在使用的許多載體都帶有一個大腸桿菌的的短區段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區中插入了一個多位點（MCS），它并不破壞讀框，但可使少數幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞。因此，宿主和質粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時存在時，可形成具有酶學活性的蛋白質。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區段的質粒之間實現了互補，稱為α-互補。由
α-互補而產生的LacZ+細菌在誘導劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時產生藍色菌落，因而易于識別。然而，當外源插入到質粒的多位點后，幾乎不可避免地導致無α-互補能力的氨基端片段，使得帶有重組質粒的細菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍白斑篩選。如用藍白斑篩選則經連接產物轉化的鈣化菌平板37℃溫箱倒置培養12-16hr后，有重組質粒的細菌形成白色菌落。
六、注意事項
1. 目的片段制備、回收、純化時，應避免外來污染。
2. 不同廠家生產的T4 連接酶反應條件稍有不同，但其產品說明書上均有最適反應條件，包括對不同末端性質分子連接的T4
連接酶的用量、作用溫度、時間等。同時提供有連接酶緩沖液（10×、5×、2×），其中多已含有要求濃度的ATP，應避免高溫放置和反復凍融使其分解。
2. 連接產物的轉化：細菌細胞經特殊試劑處理后在適當的條件下具有接收外源的能力，因此可將上述連接產物通過熱刺激或電脈沖轉化感受態細胞，當細菌大量增殖的同時，導入的重組也得到增殖。
3. 制備感受態細胞所用離心管、培養瓶最好經酸堿處理或使用新的，15 lbf/in2高壓滅菌20min。
5. 白色菌落中重組質粒內插入片段是否是目的片段需通過鑒定。