2. 連接產物的轉化
⑴ 取100μl貯存于-70℃鈣化菌，冰浴化開；
⑵ 加入適量連接產物（一般不超過10μl，輕輕混勻，冰浴20min；
⑶ 于42℃熱休克90s，迅速轉移至冰浴中，繼續冰浴2-3min；
⑷ 加入LB液體培養基200μl，于37℃緩搖孵育45min；
⑸ 將培養物適量涂于1.5%瓊脂LB平板（根據質粒性質添加抗生素或/和X-Gal/IPTG），待膠表面沒有液體流動時，37℃溫箱倒置培養 12-16hr。
五、重組子的篩選
根據載體的遺傳特征篩選重組子，如α-互補、抗生素基因等。現在使用的許多載體都帶有一個大腸桿菌的 DNA的短區段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區中插入了一個多克隆位點（MCS），它并不破壞讀框，但可使少數幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞。因此，宿主和質粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時存在時，可形成具有酶學活性的蛋白質。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區段的質粒之間實現了互補，稱為α-互補。由α-互補而產生的LacZ+細菌在誘導劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時產生藍色菌落，因而易于識別。然而，當外源DNA插入到質粒的多克隆位點后，幾乎不可避免地導致無α-互補能力的氨基端片段，使得帶有重組質粒的細菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍白斑篩選。如用藍白斑篩選則經連接產物轉化的鈣化菌平板37℃溫箱倒置培養12-16hr后，有重組質粒的細菌形成白色菌落。
六、注意事項
目的DNA片段制備、回收、純化時，應避免外來DNA污染。
2. 不同廠家生產的T4 DNA連接酶反應條件稍有不同，但其產品說明書上均有最適反應條件，包括對不同末端性質DNA分子連接的T4 DNA連接酶的用量、作用溫度、時間等。同時提供有連接酶緩沖液（10×、5×、2×），其中多已含有要求濃度的ATP，應避免高溫放置和反復凍融使其分解。
2. 連接產物的轉化：細菌細胞經特殊試劑處理后在適當的條件下具有接收外源DNA的能力，因此可將上述連接產物通過熱刺激或電脈沖轉化感受態細胞，當細菌大量增殖的同時，導入的重組DNA也得到增殖。
3. 制備感受態細胞所用離心管、培養瓶最好經酸堿處理或使用新的，15 lbf/in2高壓滅菌20min。
5. 白色菌落中重組質粒內插入片段是否是目的片段需通過鑒定。
聚合酶鏈式反應（PCR）
聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，為最常用的分子生物學技術之一。典型的PCR由（1）高溫變性模板；（2）引物與模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反應組成一個循環，通過多次循環反應，使目的DNA得以迅速擴增。其主要步驟是：將待擴增的模板DNA置高溫下（通常為 93℃-94℃）使其變性解成單鏈；人工合成的兩個寡核苷酸引物在其合適的復性溫度下分別與目的基因兩側的兩條單鏈互補結合，兩個引物在模板上結合的位置決定了擴增片段的長短；耐熱的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃將單核苷酸從引物的3’端開始摻入，以目的基因為模板從5’→3’方向延伸，合成DNA的新互補鏈。
PCR能快速特異擴增任何已知目的基因或DNA片段，并能輕易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因擴增達到納克、微克、毫克級的特異性DNA片段。因此，PCR技術一經問世就被迅速而廣泛地用于分子生物學的各個領域。它不僅可以用于基因的分離、克隆和核苷酸序列分析，還可以用于突變體和重組體的構建，基因表達調控的研究，基因多態性的分析，遺傳病和傳染病的診斷，腫瘤機制的探索，法醫鑒定等諸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有著以下多種用途：
(1) 生成雙鏈DNA中的特異序列作為探針；
(2) 由少量mRNA生成 cDNA文庫；
(3) 從cDNA中克隆某些基因；
(4) 生成大量DNA以進行序列測定；
(5) 突變的分析；
(6) 染色體步移；
(7) RAPD、AFLP、RFLP等DNA多態性分析等。
一、試劑準備
DNA模版
2．對應目的基因的特異引物
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer 5 μl
dNTP mix （2mM） 4 μl
引物1（10pM） 2 μl
引物2（10pM） 2 μl
Taq酶 （2U/μl） 1 μl
DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl
加ddH2O至 50 μl
視 PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。