1.從生物基因組群體中分離目的基因
原核生物基因組較小，基因容易定位，用限制性內切酶將基因組切成若干段后，用帶有標記的核酸探針，從中選出目的基因。真核生物一般通過基因組文庫的方法獲得目的基因。
圖10-3-1 限制性內切酶
限制性內切酶(restrictive enzyme)是20世紀60年代末在細菌中發現的，能水解DNA分子骨架的磷酸二酯鍵，使一個完整的DNA分子切成若干段，每一種限制酶，都有自己特定的作用位點，而且切口或切下來的序列，往往是回文結構（palindromes）。例如Eco RI把GAATTC在GA之間切開，形成粘性末端。也有一些限制酶作用的結果產生不含粘性末端的平整末端，如HapI。多在原核生物中存在，能識別4～6個特苷酸特定的堿基序列。限制酶對細菌有保護作用，某些入侵的噬菌體可因DNA鏈被限制性酶切斷而不能在細菌中繁殖，“限制”因此而得名。限制酶不能切開細菌本身的DNA，這是因為細菌DNA的腺嘌呤和胞嘧啶甲基化（-CH3）而受到保護之故。
這樣就可以用限制性內切酶把一個基因組DNA分成很多片段，對于原核生物比較小的基因組來說，可以直接用標記地探針來獲取在通過特定的方法，對于比較大的基因組，可以先制作基因文庫，然后釣取所需要的帶有目的基因的片段。
2.人工合成目的基因DNA片段
人工合成目的基因DNA片段有化學合成和酶促合成法兩條途徑。一般是采用DNA合成儀來合成長度不是很大的DNA片段。
3.PCR反應合成DNA
聚合酶鏈式反應（PCR)是以DNA變性、復制的某些特性為原理設計的。通過PCR技術獲取所需要的特異DNA片段在實際應用用得非常多，但是前提條件是必須對目的基因有一定的了解，需要設計引物。PCR技術的原理如下：
圖10-3-2 PCR原理圖
（1）以混合的 DNA 片段作模板，例如，可以用 cDNA 基因文庫做模板，在 90℃ 高溫下，作為模板的雙鏈 DNA 均變性，分開成為單鏈DNA。
（2）在反應體系中以有兩種合成的 DNA 小段寡聚核苷酸做引物，這兩種寡核苷酸應可以分別和特異 DNA 片段的正鏈的 3'末端與負鏈的 3'末端相結合。寡核苷酸引物要在 50℃ 的溫度下，才能較好的找到可以配對的正鏈和負鏈，形成互補結合。顯然，在混合 DNA 片段作模板的情況下，只有可以形成配對關系的 DNA 鏈才可特異性地結合引物寡核苷酸。這個過程又稱為淬火。
（3）反應體系中還有高溫 DNA 聚合酶，以及作為原材料的四種脫氧核苷三磷酸（4 X dNTP) 。高溫 DNA 聚合酶來自一種特殊的耐高溫細菌，俗稱 Taq 酶。在 70℃ 高溫下，經 Taq 酶催化，以四種脫氧核苷三磷酸為原料，在形成互補的引物寡核苷酸后，迅速合成一條與模板 DNA 單鏈（正鏈或負鏈）互補結合的DNA新鏈。
（4）以上三個步驟周而復始，即反應體系的溫度從 90oC- 50oC- 75oC，反應體系中經歷：變性（ DNA 雙鏈變性生成單鏈）——淬火（寡核酸引物和特異的 DNA 模板結合，配對）——合成（以引物為起點，合成與模板互補的 DNA 新鏈）。每次循環約需6-10分鐘。經過20次循環，能與引物特異結合的那段 DNA ——即需要放大增殖目的 DNA 分子，可以擴增106倍。
4.mRNA差異顯示法獲得目的基因
mRNA差異顯示(mRNA differential display, DD)是1992年由哈佛醫學院Peng Liang等人建立的。原理是先用PCR技術擴增所有的mRNA、生成cDNA群體，再用測序凝膠電泳獲取所需要的目的基因，然后再次用PCR擴增。簡單的講，就是從基因的轉錄產物mRNA來反轉錄成cDNA作為目的基因。
5、用機械的方法，例如超聲波把基因組打成片段。