目的基因片段與載體連接

實驗概要

本實驗介紹了目的基因片段與載體連接的操作步驟，有助于學會DNA片段的體外連接技術。

實驗原理

在Mg² 和ATP存在下，T4 DNA連接酶能催化載體分子的粘性末端與外源DNA的相同粘性末端聯接成重組DNA分子。

主要試劑

1. T4 DNA 連接酶

2. 連接酶緩沖液

3. 無菌ddH₂O

主要設備

1. 旋渦混合器

2. 微量移液取樣器

3. 移液器吸頭

4. 1.5ml 微量離心管

5. 雙面微量離心管架

6. 臺式離心機

7. 干式恒溫氣浴

實驗材料

1. pUCm-T 載體

2. Pinpoint?xa-3酶切載體

3. CHI插入片斷

實驗步驟

1. PCR產物與pUCm-T載體直接連接

   1) 事先將干式恒溫儀(或冰盒里的水)溫度設定在14～16°C。

   2) 取一個滅菌的0.2ml微量離心管，加入：

4μl PCR 產物混合液

1μl pUCm-T載體

0.5μl T4 DNA連接酶(TAKARA, 350U/ul)

1μl 連接酶緩沖液

3.5μl ddH₂O

總量 10μl 體系

   3) 上述混合液輕輕震蕩后再短暫離心，然后置于16°C水中保溫過夜。

   4) 連接后的產物可以立即用來轉化感受態細胞或置4°C冰箱備用。

2. DNA回收片斷(CHI)與載體(Pinpoint?xa-3)連接

   1) 取一個滅菌的0.2ml微量離心管，加入

4μl 回收DNA片斷

1μl 酶切后回收的載體

0.5μl T4 DNA連接酶(TAKARA, 350U/ul)

1μl 連接酶緩沖液

3.5μl ddH₂O

總量 10μl 體系

   2) 上述混合液輕輕震蕩后再短暫離心，然后置于16°C干式恒溫儀(或16°C水中)中保溫過夜。

   3) 連接后的產物可以立即用來轉化感受態細胞或置4°C冰箱備用。