目的基因片段的PCR擴增與克隆

1.PCR技術

PolymeraseChainReaction聚合酶鏈反應

它是一種模擬天然DNA復制過程，在有DNA模板、DNA聚合酶（Taq酶）、RNA引物和四種dNTP的情況下，通過高溫變性（90℃－95℃，1－2min）,低溫退火（25℃－37℃，1－2min）,中溫延伸（60℃－75℃，90sec-5min）,這樣反復循環的過程中，在體外擴增特異性DNA片段的分子生物學技術。

1）、PCR反應成分：

TaqDNA聚合酶

引物濃度：一般0.1-0.5μmol/L

dNTP:一般為50－200μmol/L

Mg²⁺

模板：PCR對模板的要求不高，單、雙鏈DNA均可，但樣品中不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑以及能與DNA結合的蛋白質。

添加劑：DMSO（二甲基亞楓），提高擴增效率及特異性

（1）理論上PCR合成產物的數量經過每輪循環都將增加一倍，應按2ⁿ的指數方式遞增，PCR反應30輪循環后，PCR擴增應達到230個拷貝，約10⁹個拷貝。但由于DNA聚合酶的質量、待擴增片段的序列及反應系統的條件等各種因素的影響，實際擴增效率比預期的要低，一般可達10⁶－10⁷個拷貝

平臺效應”：PCR反應中，當引物－模板與DNA聚合酶達到一定比值時，DNA聚合酶催化反應趨于飽和，即PCR反應不再增加。平臺效應在PCR反應中是不可避免的，但一般在平臺效應出現前，PCR產物的數量足以滿足實驗的需要。

（2）PCR反應條件的優化

PCR方法操作簡便，但影響因素頗多，因此需要根據不同的DNA模板，摸索最適條件。主要從：

反應的特異性、敏感性、真實性、擴增效率等四個方面衡量PCR反應的結果。

①循環參數 變性 退火 延伸

②PCR反應成分

（3）PCR反應引物的設計

引物的設計在整個PCR擴增中占有十分重要的地位。