目的基因的獲取3

4、基因組文庫的大小

一個文庫要包含99%的基因組DNA時所需要的克隆數目。

N：克隆數目

P：設定的概率值（如：0．99）

x：插入片段平均大小（15～20kb）

y：植物基因組大小（以kb計）

如果插入片段平均大小為 20 kb 某植物基因組大小為 4 x 106bp，P=0.99時，根據上式 N≈1 ×105。

含 1×105個克隆的基因文庫相當覆蓋了 5倍的基因組，在片段隨機分布時，從文庫中找到任一序列的概率不低于0.99。

（二）cDNA文庫

1、概念

cDNA文庫：利用某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連接，轉入細菌細胞中進行保存和擴增。

2、cDNA文庫的特點

（1）不含內含子序列。

（2）可以在細菌中直接表達。

（3）包含了所有編碼蛋白質的基因。

（4）比DNA文庫小的多，容易構建。

3、構建

cDNA文庫構建共分四步：

①細胞總RNA提取并分離純化出mRNA；

②合成cDNA第一鏈；

③將mRNA－DNA雜交分子轉變成雙鏈cDNA；

④雙鏈cDNA重組到載體上。

前3步為cDNA合成，第④步為cDNA克隆。

舉例：

定向cDNA克隆的方法。(a)早期的策略，其中環的形成是用來在雙鏈cDNA的開放末端放置一個特異性接頭(在此例中為Sal I的)的。連接之后，環經切割并用S1核酸酶處理，再將EcoR I接頭加到兩個末端上。用EcoR I和Sal I裂解可以產生一個限制性片段，該片段可以單向插入到經同樣的酶切割后的載體中去。（b）一個近似的策略，但是第二條cDNA鏈的合成是隨機引導的。用寡聚T引物延伸形成一個Sal I位點。在第二條鏈的合成中，這就形成一個雙鏈化的Sal I接頭。再向兩個末端都加入另外的EcoR I接頭，就使cDNA可以像上面所說的那樣進行單向克隆。(c)Okayama和Berg的策略(1982)，其中mRNA在cDNA合成之前就在cDNA尾巴輔助下單向連接到質粒克隆載體上