原位PCR是原位雜交細胞定位和PCR的高靈敏度相結合的技術，使得靶基因檢測有了極大的改進。此技術是在細胞（爬片、甩片或涂片）或組織（石蠟、冰凍切片）上直接對靶基因片段進行擴增，通過摻入標記基團直接顯色或結合原位雜交進行檢測的方法。
1．組織切片和細胞樣品的制備
【試劑與配置】
10%福爾馬林
二甲苯
PBS
【操作方法】
（1）用10%福爾馬林固定組織8~15hr，石蠟包埋，切片（4μm），將切片置于新鮮的二甲苯中處理5min，放入無水乙醇中浸泡 5min，取出，空氣干燥；
（2）對于培養細胞，可直接制備爬片，也可有PBS洗細胞一次，加10%福爾馬林靜置過夜，用橡膠刮下細胞；用PBS洗細胞兩次，2000rpm×3min，用5ml PBS重懸細胞，即可用甩片機甩片或直接吸50μl點在載玻片上。
2．切片預處理（蛋白酶消化）
【試劑與配置】
0.1mol/L Tris-HCl (pH7.4)
緩沖液A：0.1mol/L Tris-HCl (pH7.4),0.3% Tween-20,0.5% NP-40
蛋白酶K：20-50μg/ml，溶于TE中
【操作方法】
（1）干燥后的切片置于0.1mol/L Tris-HCl (pH7.4)中，室溫孵育5min；
（2）浸入緩沖液A中，室溫孵育10min；
（3）滴加20μl蛋白酶K液于標本上，在濕盒中37℃孵育20min；
（4）在室溫下，用0.1mol/L Tris-HCl (pH7.4)漂洗兩次，每次5min。
3．原位擴增（以標記生物素為例）
【試劑與配置】
PCR反應緩沖液：兩種引物各100pmol，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各200μmol， Bio-dUTP 50mol，1×PCR緩沖液；
Tag酶：5U/μl
緩沖液B：0.01mol/L PBS，0.1% Triton-X100
指甲油（市售）
無水乙醇
【操作方法】
（1）切片用1×PCR緩沖液平衡3次，每次5min；
（2）用濾紙吸去切片上多余的液體，置60℃，每片加入30μl PCR反應緩沖液，5U Tag酶，用蓋玻片封片，四周封以指甲油，防止蒸發；
（3）94℃變性5min，按下列條件（94℃×2min，55℃×2min，72℃×3min）循環20~25次后，72℃延伸5min；
（4）玻片浸入無水乙醇中10min，以軟化指甲油；
（5）用刀片撬開蓋玻片并除去；
（6）用緩沖液B漂洗兩次，每次3min；
（7）用無水乙醇固定5min，并吹干。
4．檢測（以ABC法為例）
【試劑與配置】
緩沖液C：0.1mol/L Tris-HCl (pH7.5)，0.1mol/LNaCl，2mmol/L MgCl2， 0.5% Triton-X100
封閉液：3%BSA（溶于緩沖液C中）
顯色液：0.05%DAB，溶于0.05mol/L Tris-HCl (pH7.4)，臨用前每10ml加30%過氧化氫50μl
1%鹽酸酒精液
蘇木素染色液
【操作方法】
（1）用30μl 3%BSA滴加在玻片上，封閉1hr；
（2）用緩沖液C簡洗1min，每片滴加ABC復合物20～30μl，室溫放置40min；
（3）緩沖液B室溫漂洗3次，每次15min；
（4）滴加顯色液于玻片上，鏡下觀察控制顯色時間（一般7～14min）；
（5）流水洗片，浸入蘇木素液中復染30s，1%鹽酸酒精分化（提抽2次）；
（6）常規脫水、透明、封片，鏡下觀察。