一、原理
同大腸桿菌一樣，根癌農桿菌細胞在對數生長的早中期，經一定濃度的CaCl2處理后也可進入感受態。通過低溫處理和37℃熱擊可使中間載體質粒DNA容易進入到根癌農桿菌細胞中，并在其中復制與表達。已攝入外源質粒DNA的細胞可在含有適當抗生素的培養基上生長，而不含質粒細菌則不能在上面生長，借此可分離出攜帶中間載體質粒的根癌農桿菌。
二、目的
進一步了解中間載體質粒的特性，掌握中間載體質粒直接轉入根癌農桿菌的原理和方法。
三、材料、試劑和器具
1、受體菌：農桿菌LBA4404（Rifr）。
2、中間載體質粒DNA（pBI 121, Kanr）。
3、20mmol/L CaCl2。
4、YEB液體和固體培養基（含相應抗生素）。
5、液態氮。
6、分光光度計。
7、冰塊。
四、操作步驟
（一）感受態細胞制備
1、挑取一個單菌落接種于5mlYEB液體培養基中，28℃振蕩（250rpm）培養過夜。
2、取2ml過夜培養物轉入50ml YEB液體培養中，繼續培養至OD600值約等于0.5。
3、將新鮮培養物轉入50ml無菌離心管，冰浴中靜置30分鐘。
4、5000rpm離心5分鐘，棄去上清液。
5、加入2ml預冷的20mmol/L CaCl2重懸菌體。
6、分裝于無菌的Eppendorf管中，每管200ul，保存于4℃備用。
（二）轉導
1、于一干凈無菌的Eppendorf管中，加入20mg純化的中間質粒DNA和200ml感受態細胞，混勻。
2、在冰上放置5分鐘，轉入液氮中冷凍8分鐘，然后迅速轉移到37℃水浴中溫育5分鐘。
3、加入800ul YEB液體培養基，28℃搖床上（250rpm）培養（預表達）4－5小時。
4、用微量加樣器將轉化的農桿菌移到含相應抗生素的YEB固體選擇培養基平板上，用無菌玻棒涂布均勻。
5、室溫下靜置15分鐘，然后倒置在28℃培養箱內，培養2－3天，直到長出單菌落。