| 實驗步驟 |
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
去除 RNA 酶的雙蒸水
10XRT-PCR 緩沖液（100 mmol/LTris-HCl、pH8.3，500 mmol/LKCl,15 mmol/LMgCl2)
2. 酶和酶緩沖液
MMLV 逆轉錄酶（100-200U/ul)
SUPERaseINRNA 酶抑制劑（20U/ul;Ambion)
Taq DNA 聚合酶（5U/ul)
3. 核酸和寡核苷酸
總 RNA(每個樣品達到 2.5ug)
隨機引物（50umol/L)
dNTP 混合物（10 mmol/L，包含所有四種 dNTP)
基因特異的正向引物（5umol/L)
基因特異的反向引物（5umol/L)
4. 放射性復合物
[a-32P]dCTP(10uCi/ul)(lCi=37 GBq)
5. 實驗器材
Quantu mRNA Universal 18S standards (Ambion; 包括 18S PCR 引物對和 18S PCR 競爭子）
薄壁的 PCR 管
專用儀器
可編程的 PCR 儀
二、方法
1. 如方案 1 所述，集中運行單鏈 cDNA 合成反應，決定所有犇品的線性范圍時使用同樣量的 RNA。
2. 在冰上準備 PCR 反應混合物。
10XRT-PCR 緩沖液 50ul
10 mmol/LdNTP 混合物 40ul
5umol/L 基因特異的正向引物 20ul
5umol/L 基因特異的反向引物 20ul
18S rRNA 引物和競爭子（以方案 2 決定的比例添加） 40ul
5U/ulTaq DNA 聚合酶 rk; 2.5ul
[a-32P]dCTP(10uCi/Hl) 5ul
去除 RNA 酶的雙蒸水 312.5ul
3. 在 9 個薄壁 PCR 管中分別添加 49ul 的 PCR 反應混合物。
4. 加 1ulddH20 于不加模板的對照管中。
5. 加1ul 每種樣品 RNA 到相應的非反轉錄對照管中。
6. 加 1ul 從第一步 cDNA 合成反應中得到的每種樣品的 cDNA 到相應的管中。
7. 做 PCR, 如方案 1 所述，使用擴增線性范圍決定的最佳循環數。
8.
如方案 1 所述，用變性凝肢電泳來分析實驗結果。不加模板的對照和非反轉錄對照應沒有 PCR 產物產生。定置樣品 PCR
產物的相對含量，可以用基因特異性產物的信號除以 18S rRNA
的信號，從而可以得到每個樣品中基因特異產物的準確相對值，這些值可以用來比較樣品間模板 RNA 的相對表達量。用樣品 1 的標準化信號/樣品 2
的標準化信號可以得到一個比值，以倍數或百分比表示。相對定量 RT-PCR 的實例見圖 13-4。
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