相差顯微鏡使用實驗

圖1 相差顯微鏡的成像原理及裝置圖

釀酒酵母水浸片枯草桿菌水浸片

相差顯微鏡聚光器相差物鏡顯微鏡合軸調節望遠鏡綠色濾光片載玻片蓋玻片

1.  將顯微鏡的聚光器和接物鏡換成相差聚光器和相差物鏡，在光路上加綠色濾光片。
 

2.  聚光器轉盤刻度置“0”，調節光源使視野亮度均勻.
 

3.  將釀酒酵母水浸片或枯草芽孢桿菌水浸片置于載物臺上，用低倍物鏡（10X）在明視野配光并聚焦樣品。
 

相差顯微鏡鏡檢對載玻片、蓋玻片的要求很離，載玻片厚度應在1.0 mm左右。若過厚，環狀光闌的亮環變大，過薄則亮環變小；載玻片厚薄不均，凹凸不平，或有劃痕、塵埃等也都會影響圖像質量。而蓋玻片的標準厚度通常為0.16-10.17 mm，過薄或過厚都會使像差、色差增加，影響觀察結果。
 

4.  將聚光器轉盤刻度置“10”（與所用10x物鏡相匹配），注意由明視野轉為環狀光闌時，因 進光量減少，要把聚光器的光圈開足，以增加視野亮度。
 

5.  取下目鏡，換上合軸望遠鏡。用左手指固定望遠鏡外筒，一邊觀察，一邊用右手轉動其內筒，使其升降，對焦使聚光器中的亮環和物鏡中的暗環淸晰；當雙環分離時，說明不合軸，可用聚光器的中心調節螺旋移動亮環，直至雙環完全重合（圖3，B）。
 

6.  按上法依次對其他放大倍數的物鏡和相應的壞狀光闌進行合軸調節。
 

精確的合軸調節是取得良好觀察效果的關鍵，若環狀光闌的光環和相塞物鏡中的相位環不能精確吻合會造成直射光和繞射光的光路素亂，應被吸收的光不能吸收，該推遲相位的光波不能椎遲，失去相差顯微鏡的效果。
 

7.   取下望遠鏡，換回目鏡，選用適當放大倍數的物鏡進行觀察。

一、相差顯微鏡構造

相差顯微鏡與普通光學顯微鏡在構造上的不同在于用環狀光闌代替可變光闌，用帶相板的相差物鏡代替普通物鏡，及需用合軸調節望遠鏡來校直光軸并使用濾色片。
 
1.  環狀光闌

相差顯微鏡的聚光器光闌是環狀光闌，照明光線只能從環狀的透明區迸人聚光鏡再斜射到標本上（斜射角度遠小于暗視野聚光器），產生直射光和繞射光。大小不同的環狀光闌與聚光鏡一起形成轉盤聚光器，其轉盤前端有標示孔，表示位于聚光鏡下面的光闌種類，不同的光闌應與各自不同放大率的物鏡配套使用。例如，標示孔的符號為“10”時，表示應與10×物鏡匹配；符號為“0”時，為明視野非相差的通光孔（圖2A）。

圖2  用于相差顯微鏡的環狀光闌（A）和合軸調整望遠鏡（B）

2.  相差物鏡（鏡頭上標有PC或PH宇樣）

物鏡的后焦平面上裝有相板，這是相差顯微鏡的主要裝置。相板由與環狀光闌相對應的環狀共軛面和補償面（共軛面的內外側部分）兩部分組成，分別透過直射光和繞射光。通過涂在相板上的吸收膜和推遲相位膜，直射光和繞射光會發生光強度減弱及相應改變，再通過兩者的干涉作用，將相位差變為振幅差。如果是部分吸收直射光而推遲繞射光的相位可產生暗反差（形成明亮的背景和暗的標本），反之，如果是部分吸收繞射光而推遲直射光的相位則產生明反差（標本是明亮的而背景是暗的）。

3.  合軸調節望遠鏡

由于環狀光闌的光環和相差物鏡中的相位環很小，在合軸調節中必須使用特別的低倍望遠鏡（圖2，B），保證兩環的環孔相互吻合，光軸完全一致（圖3）

圖3 相差顯微鏡照明合軸調整
A：環狀光闌形成的亮環小于相板上暗環，B：正確照明，亮環與暗環重合，C：環狀光闌中心不合軸。

4.  濾光片

進行相差顯微鏡觀察時一般都使用綠色濾光片。這是因為相差物鏡多屬消色差物鏡，這種物鏡只糾正了黃、綠光的球差而未糾正紅、藍光的球差，在使用時采用綠色濾光片效果最好。另外，綠色濾光片有吸熱作用（吸收紅色光和藍色光），進行活體觀察時比較有利。