對真菌的診斷需要了解真菌寄生的部位，完整的病史，包括職業、業余愛好和旅游史。實驗室檢查一般采用直接鏡檢和真菌培養兩種方法即可確診。必要時再進行生化實驗、血清學反應或動物接種等。
標本的采集 用無菌操作收集適宜部位的標本，可疑淺部真菌感染應取病變部位的毛發、指（趾）甲屑及皮屑等，可疑深部真菌感染的病人應根據臨床癥狀和體征選取血液、腦脊液或分泌物、排泄物及痰液等并及時檢查，一般不超過1～2小時，以免變質污染。
真菌的直接鏡檢 皮屑、指（趾）甲和毛發等致密而難以透明的標本應先用10%的KOH微加溫處理，溶解角質層和細胞基質，然后進行鏡檢。膿、痰或血標本可直接涂片鏡檢。鏡下觀察是否有孢子、菌絲或假菌絲。若懷疑新生隱球菌等有莢膜的真菌感染，根據所致疾病選取標本，經墨汁負染后鏡檢，見有芽生菌體外圍繞著寬厚的莢膜即可做出診斷。
真菌的分離培養 一般用于直接鏡檢不能確診時。病原性真菌培養用沙保弱培養基（pH5.6，不適宜細菌生長）培養，為了防止細菌或腐生性真菌的污染，經常加入放線（菌）酮、青霉素、鏈霉素或其他抑制性抗生素。如果是皮膚、毛發和甲屑等標本，需經70%乙醇或2%石炭酸浸泡2～3分鐘殺死雜菌，再經無菌鹽水洗凈后接種于沙保弱培養基上，在25℃～28℃的條件下培養數日至數周，觀察菌落特征。
可疑深部真菌感染的標本可接種于血平板、肉渣培養基或硫酸鈉肉湯內，分別在室溫和37℃培養數日至數周。必要時可在玻片上做真菌小培養，能在光鏡下觀察真菌的形態和結構的特點及生長發育的全過程，便于鑒別。陰道或口腔粘膜處標本可直接用棉拭子取材，在血平板上分離。血液標本需事先增菌，腦脊液標本則取其沉淀物接種于血平板上，于37℃培養。若疑為假絲酵母菌，可取菌落接種于0.5ml血清試管內，37℃1h后涂片，革蘭染色后鏡下見有假絲酵母菌細胞長出芽管即可初步鑒定為白假絲酵母菌。
血清學診斷可輔助檢查深部真菌感染。通常使用的方法是乳膠凝集和補體結合等試驗。用乳膠凝集試驗可檢測腦脊液或血液中新生隱球菌的莢膜抗原，經有效治療后，其抗原效價下降；但是在AIDS患者合并新生隱球菌感染時，抗原效價經常會在長時間內維持高水平。但主要問題是多種真菌細胞壁缺乏具有免疫原性的成分。
核酸雜交探針技術 已經用于深部感染真菌的特異性鑒定。從培養物中提取RNA，加入標記化學發光化合物的單鏈DNA探針。當培養物中出現目的真菌，相應的DNA探針與其RNA雜交。本實驗方法只需要最小量的真菌生長物（通常少于5天），與經典方法比較，更節省時間，可應用于絲狀真菌或酵母型真菌的檢查。另有檢測真菌DNA中的G+C mol%、隨機擴增多態性DNA（RAPD）和PCR限制性酶切片長度多態性分析（PCR-RFLP）等技術的應用。與經典方法比較，這些技術敏感、省時，無疑會推動真菌感染性疾病的診斷水平向前發展。