真菌纖維素酶基因的克隆與表達

隨著現代生物技術的迅猛發展，越來越多的真菌纖維素酶基因得到克隆和表達。經過對比發現，不同真菌菌株的同一類型的纖維素酶基因有較高的同源性，但同一菌種不同類型的纖維素酶基因間的同源性相對較低[8]。已知里氏木霉有8個纖維素酶基因得到克隆，包括編碼纖維二糖水解酶的cbh1、cbh2和編碼內切葡聚糖酶的egl1、egl2、egl3、egl4和egl5[9]，以及編碼β-葡萄糖苷酶的bgl4。測序比對發現，cbh1與egl1同源性為52％；cbh2與egl3整體同源性很小，而且它們與cbh1和egl1兩個基因基本上不存在整體同源性；而里氏木霉cbh1與綠色木霉cbh1基因的同源性達95％，里氏木霉egl3與裂褶菌egl1基因的同源性也較高。由此可以看出，不同類型的纖維系酶基因的進化是各自獨立的，在進化之初可能只存在一個纖維素酶基因，它編碼糖酵解酶的前體，但由于進化選擇的壓力，這一基因發生了突變進化，通過這種歧異進化，形成了一個復雜的真菌纖維素酶基因家族[10]。這種進化是纖維素酶對天然纖維素復雜結構的適應。

通過構建基因工程菌來提高纖維素酶產量和質量已成為推動纖維素酶廣泛應用于飼料業生產中的重要手段。幾乎所有已克隆的纖維素酶基因都已在大腸桿菌中得到表達。但是這一原核表達系統的表達水平很低，產生的酶多數不能分泌到胞外，因而難以提取。為了得到胞外分泌產物，一些纖維素酶基因已在枯草芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、乳酸發酵短桿菌和變青鏈霉素等中得到了有效表達。但由于纖維素酶基因在異源宿主中的表達要遇到蛋白酶水解和糖基化等問題，其分泌機制尚不清楚，無法達到纖維素酶生產要求。所以現在大多采用真核表達系統來表達纖維素酶基因。

真菌纖維素酶基因在酵母中的表達是纖維素酶用于工業生產的一個重要途徑。這是因為，酵母可以克服在原核表達系統中無法進行特定翻譯后修飾的缺陷，不產生毒素，是一種較為理想的真核表達系統；用其表達纖維素酶基因，其產物高度糖基化，表達水平高，而且產物直接分泌至胞外。如Godbole等[11] （1999）將T. reesei cbh1在Pichia pastoris中成功地轉化并表達。肖志壯等[12](2001)利用PCR法從瑞氏木霉cDNA文庫中擴增出內切葡聚糖酶1(egl1)全長基因并克隆到釀酒酵母非整合型表達載體pAJ401上，表達出具有活性的egl1酶蛋白。近年來，以Aspergillus oryzae為表達系統的研究也漸漸增多。Takashima等[13](1999)將T. reesei bgl2 基因在A. oryzae中表達成功，酶活檢測顯示了EG酶活性。

但是，目前利用酵母表達外源纖維素酶基因的水平有限，故如何建立有效的纖維素酶基因真菌表達體系，提高酵母表達纖維素酶的產量有待進一步研究[14]。