真菌RNA提取實驗

菌絲體

NaCl 蒸餾水 SDS Tris-HCl EDTA DEPC SSTE 乙醇 酒精 酚：氯仿：異戊醇 LiCl

液氮罐 離心管 離心機 水浴鍋 冰箱 紫外分光光度計 電泳儀

1.  實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱，離心管中加入ME（巰基乙醇），（10 mL加80 ul，50 mL中加入300 ul）。

2.  取約0.8 g菌絲體（液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可，固體培養就更好說了），在液氮中迅速磨成精細粉末，裝入50mL離心管，按1g材料8 mL的量加入預熱的RNA提取液，顛倒混勻。
 

3.  65℃水浴3-10 min，期間混勻2-3次。
 

4.  加入等體積的酚（注意是酸酚pH4.5）:氯仿:異戊醇（25:24:1）抽提（10 000 rpm，4℃，5 min）。
 

5.  取上清，等體積的氯仿:異戊醇（24:1）抽提（10 000 rpm，4℃，5 min）。
 

6.  加入1/4V體積10 M LiCl溶液，4℃放置6h以上（或過夜）。
 

7.  10 000 rpm，4℃離心20 min。

8.  棄上清，用500 ul SSTE溶解沉淀。
 

9.  酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）抽提兩次，氯仿:異戊醇（24:1）抽提1次（10 000 rpm，4℃，5 min）。
 

10.  加2V體積的無水乙醇，在-70℃冰箱沉淀30 min以上。
 

11.  12 000 rpm，4℃離心20 min。
 

12.  棄上清。沉淀用70%酒精漂洗一次，干燥。
 

13.  加200 ul的DEPC處理水溶解。
 

14.  用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量。

（在抽提過程中，若蛋白質含量或其它的雜質還較多，可以增加抽提次數。）

提取RNA請盡量在低溫下操作，如果條件不容許，在室溫下操作的時間要盡可能的短。

實驗試劑準備

1.  RNA提取緩沖液（CTAB）：2% CTAB（W/V），2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP（W/V），100 mM Tris-HCl（pH8.0，DEPC處理的水配置），25 mM EDTA，0.5 g/L 亞精胺Spermidine，2.0 M NaCl，2%巰基乙醇（V/V，使用前加入）。由于在高溫滅菌條件下，Tris-HCl要和DEPC發生反應，所以配RNA提取緩沖液時直接用DEPC處理的水配制即可。

2.  SSTE：1 M NaCl，0.5% SDS（W/V），10 mM Tris-HCl pH8.0，1.0 mM EDTA。

3.  10 M LiCl 直接用蒸餾水配10 M LiCl，加1‰的DEPC過夜后，高溫滅菌。

4.  DEPC處理水 用1‰的DEPC處理蒸餾水過夜，高溫滅菌。

5.  3M NaAc，氯仿:異戊醇（24:1），酚（pH4.5）:氯仿:異戊醇（25:24:1），無水乙醇，70%酒精。