研究人員開發基于拉曼組的細菌藥物應激效應成像技術

　　在國家自然科學基金項目（項目編號：91231205，31327001，31425002）等資助下，中國科學院青島生物能源與過程研究所徐健課題組及其合作者創立了基于重水（D2O）標記單細胞拉曼成像的藥物抗菌效果評價技術，實現了在單個細菌細胞精度下藥物對細胞代謝活性抑制性的快速精確測量，有可能成為指導臨床精準用藥的新標準之一，研究成果以“Metabolic-Activity-Based Assessment of Antimicrobial Effects by D2O?Labeled Single-Cell Raman Microspectroscopy”（基于重水標記單細胞拉曼成像的抗菌代謝活性檢測）為題于2017年3月10日在線發表在Analytical Chemistry上。

　　論文鏈接：http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.analchem.6b05051。

　　單個活體細胞是生命的基本單元與進化單位。單細胞功能基因組技術能夠從深度、靈敏度和通量三個維度來探索“生命體系的異質性機制”等基礎生物學科學問題以及突破對“尚不可培養微生物”研究的技術瓶頸。徐健研究員課題組研制的“基于拉曼分選的單細胞遺傳分選儀”已實現不需標記、基于生化表型的單細胞分選，并針對分選出的單細胞能夠在微流芯片上進行集成分析，將現代組學分析手段深化與拓展到單細胞層面。

　　目前，在必須使用抗生素治療的臨床案例中，有30%-50%存在治療方案制定、抗生素選擇與療程等方面的錯誤。細菌感染中的抗生素不當使用，一方面可能導致貽誤病情，甚至造成人體菌群紊亂，誘導其它疾病發生，另一方面還會加速耐藥菌的出現。因此，準確全面的抗菌效果評價技術目前是實現快速、準確、有效的抗生素用藥的前提和基礎。作為目前微生物藥敏試驗、抗菌藥效評價和臨床抗菌方案制定的主流標準與主要依據之一，MIC（minimum inhibitory concentration）指數（體外培養細菌24小時后能抑制培養基內病原菌生長的最低藥物濃度）的測量過程費時費力，且對實驗室難以培養或生長緩慢的病菌無法檢測。另外，MIC僅從抑制細菌數目擴增的角度反映與測量藥效，卻不能檢測處于“NGMA”（Non-Growing but Metabolically Active）狀態（藥物作用下已經不再增殖但仍然具備代謝活性）的存活細胞，導致在臨床上仍然可能引起復發性感染和誘導耐藥菌出現。

　　針對上述抗菌素藥效檢測的瓶頸，徐健研究員課題組應用基于拉曼分選的單細胞分析儀，開發了基于拉曼組（Ramanome）的細菌藥物應激效應成像技術。徐健研究員與中山大學光華口腔醫院合作，以導致齲齒的變形鏈球菌（Streptococcus mutants）與多種臨床常用抗菌藥物為模式，研究單細胞拉曼成像精確測量細胞利用胞外重水（D2O）分子的速率，而后者與該細胞的代謝活躍程度呈高度的正相關。該方法從對微生物代謝活性抑制的角度定量測量藥效，能發現處于“NGMA”狀態的細胞。同時，由于與重水標記耦合的拉曼成像具備單個細菌細胞的檢測精度，對于大部分細菌、古細菌和真菌，實現了測量同一樣品內不同細胞之間在藥物抗菌消炎上的差異程度。另外，該方法能夠在30分鐘內快速區分氟耐受型和氟易感型的變形鏈球菌，藥效檢測與評價的速度顯著提高。

　　基于上述單細胞成像分選與功能分析技術，徐健研究員及其合作者提出了“基于代謝活性的最低抑菌濃度”（MIC-MA指數）的抗菌藥效指標：藥物作用8個小時后所有細胞代謝活性全部并且徹底被抑制的最低藥物劑量。他們發現，對于特定的病菌和特定的抗菌藥物，MIC-MA指數與MIC指數有顯著的不同，如在高達60倍MIC的氨芐西林劑量時，仍然存在高比例的“NGMA”狀態變形鏈球菌細胞，有可能發生抗生素壓力消失時鏈球菌復發感染。與目前臨床普遍參照的MIC指數相比，MIC-MA指數有重要特色與優勢。

　　更重要的是，傳統的MIC檢測是將受試微生物作為同質化的群體，而忽視了針對細胞之間藥效一致性的考察與評價，而MIC-MA在單個細胞精度的藥敏性與藥效檢測，在考察耐藥性形成和細菌微進化的機制等生命科學基礎研究方面具有重要意義。

　　相關技術與方法已申請國家ZL四項。

圖. 基于重水標記單細胞拉曼成像的抗菌代謝活性檢測方法