研究構建染色體融合小鼠模型、模擬染色體演化過程

　　9月21日，Cell Research在線發表了中國科學院分子細胞科學卓越創新中心（生物化學與細胞生物學研究所）李勁松研究組撰寫的題為Creation of artificial karyotypes in mice reveals robustness of genome organization的論文。該研究報道了基于類精子干細胞介導半克隆技術，通過CRISPR/Cas9靶向染色體重復序列，實現小鼠染色體融合改造，建立全新的穩定傳遞的染色體改造純和小鼠品系，揭示了染色體融合的機制，并闡釋了真核生物基因組組裝的系統穩健性（Robustness）是染色體演化的重要基礎。

　　染色體的穩定與變化是個體生存和物種演化的基礎，也是遺傳物質宏觀調控規律的一體兩面。染色體數目和結構的變異對個體造成不利影響，而新物種的形成往往又伴隨復雜的染色體結構演化。系統生物學研究顯示，距今約3到4百萬年前，人與黑猩猩的共同祖先內部產生了染色體結構上的分異，兩條獨立的染色體通過頭對頭（類似羅氏易位，Robertsonian translocation）方式融合成為現代人的二號染色體（HSA2），這可能直接導致人類始祖與黑猩猩始祖之間的生殖隔離，成為人類物種進化的關鍵性事件。然而，這一事件發生的具體機制尚不清楚。

　　實驗室常用小鼠（Mus musculus）的核型為40條染色體，在長期配繁過程中保持染色體數目和結構穩定，除Y染色體外，均為端著絲粒染色體（單臂染色體），這與人類染色體差異巨大。人類染色體中未發現端著絲粒染色體，而均以雙臂染色體形式存在（包括近端著絲粒染色體）。然而，自然界中，野生小鼠存在較為廣泛的染色體羅氏易位類型（端著絲粒染色體頭對頭融合）亞種，而羅氏易位類型分布不均衡，例如，Rb（2，4）（2號和4號染色體融合）融合類型和Rb（5，15）等融合類型在亞洲，歐洲美洲各地廣泛分布，但Rb（1，13）和Rb（2，9）等融合類型尚未見報道。這引起了一系列思考，染色體融合如何發生？為什么小鼠的染色體演化存在端著絲粒偏好性？不同類型的染色體融合方式是否影響細胞和個體的生命活動？如何將小鼠的單臂染色體改造成更像人類染色體的雙臂染色體？

　　2018年，中國科學家團隊在國際上率先實現基于酵母的大規模染色體改造，利用頭對尾的融合方式，將酵母染色體合并為一條，為染色體重排改造研究打開了一扇窗，但面對更復雜的哺乳動物，在個體水平改造染色體在技術上面臨困難和挑戰。在單基因突變和多基因突變遺傳均可以高效建模的今天，攻克哺乳動物染色體結構變異建模是重要任務，而我國科學家獨創的類精子干細胞技術為實現哺乳動物個體水平染色體改造投來了光亮。2022年8月26日，中科院動物研究所團隊利用相似的頭對尾的融合方式，獲得了三只19對染色體的小鼠（Science）。

　　李勁松團隊針對著絲粒核心基序Minor satellite（MinSat）設計了基于CRISPR/Cas9的靶向編輯方案，實現對著絲粒區域的靶向切割。將這樣的著絲粒靶向切割系統轉染到小鼠類精子干細胞中，可實現對小鼠兩條染色體在著絲粒區域以“頭對頭”融合的方式發生羅氏易位，形成雙臂染色體，模擬了自然界中在漫長演化過程中發生的染色體重排事件。研究在1128個轉染著絲粒切割組件的單克隆細胞系中，建立了10株具有穩定的19條染色體的單倍體細胞系，其中有9株細胞系保持有基因組倍性平衡。

　　染色體著絲粒斷裂融合形成了一個新的著絲粒。研究發現，所有和小鼠二號染色體（Chr2）發生羅氏移位之后形成的雙臂染色體具有兩個獨立的著絲粒（MinSat富集區域）。進一步分析顯示，小鼠Chr2與其他染色體不同，即在染色體末端具有兩個著絲粒。雙著絲粒染色體會造成在有絲分裂中存在不穩定性，易造成染色體斷裂和基因組不穩定性。進一步分析發現，小鼠Chr2具有一個活化的著絲粒和一個失活的著絲粒。這暗示小鼠Chr2染色體和其他染色體相比，在進化歷程中存在特殊的著絲粒形成事件。

　　染色體融合事件對于細胞的生命活動有何影響？研究對具有不同羅氏易位的細胞系進行轉錄組測序分析發現，攜帶單條羅氏易位染色體的“類精子干細胞”只具有最多不超過20個差異基因，這說明染色體“頭對頭”的融合方式對細胞表達譜擾動小，差異基因同時分布在參與融合和其余未參與融合的染色體上。

　　考慮到3D基因組結構對轉錄調控和進化都是重要的，研究考察了染色體融合對3D基因組結構的影響。羅氏易位細胞系和Wild-type細胞系相比，A/B compartment和TAD高度相似。此外，接近90%的染色質之間的顯著相互作用可以在羅氏易位細胞系和Wild-type細胞系中同時被檢測到。染色體融合直接拉進了兩條染色體的物理距離，表現為兩條染色體之間相互作用更加頻繁。在著絲粒區域以及端粒區域，這種相互作用增強的趨勢更加明顯。研究還發現，小鼠Chr11與其余染色體相互作用在發生染色體融合后表現出較強的變化，即使其未參與到染色體融合事件。染色體融合對基因組結構和基因表達調控影響較小，這說明細胞內基因組結構及表達調控存在穩態調控，體現系統穩健性（Robustness）。

　　類精子干細胞具有替代精子使卵母細胞“受精”的能力，將染色體融合改造的類精子干細胞注入卵子后可以產生健康“半克隆”小鼠，并可以通過繁育獲得攜帶純和融合染色體的小鼠品系，在實驗室條件下實現了哺乳動物的核型演化事件。該研究建立了四個獨立的純和染色體融合小鼠品系，雌雄純和小鼠可自由配繁穩定傳遞融合染色體。

　　進一步，研究嘗試了在單重染色體融合的類精子干細胞上進行疊加切割，產生了二重甚至三重染色體融合的類精子干細胞。隨著染色體融合事件的疊加，細胞差異基因數目逐漸增加，這些基因同樣分布在參與融合和未參與融合的染色體上，這暗示了染色體融合事件的累積帶來轉錄組整體水平的擾動。多重融合的類精子干細胞作為父源遺傳物質供體依然可以支持半克隆小鼠的產生，一步實現多重染色體融合小鼠模型的建立。

　　本研究證實著絲粒的斷裂導致的染色體融合是染色體演化的原因、真核生物基因組組裝的系統穩健性（Robustness）是染色體演化的重要基礎。該研究為哺乳動物進行染色體結構的改造、動物新核型亞種的創造以及染色體結構變異疾病的模擬提供了可行的技術路線，開啟了以小鼠為代表的哺乳動物染色體遺傳改造的新領域。

　　研究工作得到科技部、國家自然科學基金、中科院及上海市科學技術委員會等的資助，并獲得分子細胞卓越中心動物實驗技術平臺和細胞分析技術平臺的支持。