| 實驗步驟 | 一、材料和設備
蓖麻、煙草、向日葵、油菜、小麥或棉花的葉片。
721型分光光度計、真空泵（或注射器）、保溫箱、天平、真空干燥器、打孔器、三角瓶、移液管、燒杯
藥品
0.1 M 磷酸緩沖液（pH7.5）
0.2 M KNO3溶液
磺胺（對氨基苯磺酸胺）試劑：1克磺胺溶于25毫升濃鹽酸后再用蒸餾水稀釋至100 ml 。
α－萘胺試劑：0.2克α萘胺溶于25 ml 濃鹽酸中，再用蒸餾水稀釋至100 ml 。
NaNO2標準溶液：1克NaNO2溶于1000 ml 蒸餾水中配成NaNO2母液。實驗時按處理稀釋成要求濃度。如1微克/ ml ：取母液1 ml ，用蒸餾水稀釋成1000 ml 。
二、實驗步驟
1．將新鮮取回的材料葉片用水清洗后用吸水紙吸干水份。用打孔器取下直徑為1厘米的園片，再用蒸餾水洗2－3次，將蒸餾水吸干。在天平上稱取等重的葉子園片兩份：每份0.4克左右（或每份取50個園片）。將兩份園片分別置于下列兩種溶液中，容器使用50 ml 三角瓶。
（1）0.1 M 磷酸緩沖液5 ml +蒸餾水5 ml 。
（2）0.1 M 磷酸緩沖液5 ml +0.2 M KNO3溶液5 ml 。
將三角瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽氣，使園片沉于瓶底（也可將園片置于注射器中抽氣）。將三角瓶置于30℃溫箱中（黑暗）保溫30分鐘，然后分別取兩種溶液各1 ml ,準備測定NO2－含量。
（注意取葉前葉片要進行過一段時間的光合作用。若組織中碳水化合物含量降低使此酶的活性降低。當組織內含糖量低時，可在反應液中加入30μ M 3－磷酸甘油醛或1，6－二磷酸果糖，可顯著增加NO2－的產生）。
2．繪制標準曲線：磺胺比色法可測出低于1微克/ ml 的NaNO2含量。在0－5微克/ ml 濃度范圍內繪制標準曲線。顯色反應的速度與重氮化作用的速度及偶聯反應的速度相關，因此受溫度、酸堿度等影響，也造成靈敏度的變化，若標準樣品與測定樣品在相同條件下測定，則顯色速度也相同，可以作比較。
吸取不同濃度的NaNO2溶液各1 ml 于試管中，（設置NaNO2溶液處理可為5、4、3、2、1、0微克/ ml ）加入磺胺試劑2 ml 及α－萘胺試劑2 ml ，混合搖勻。在30℃溫箱中保溫30分鐘后立即于比色計上比色，用50號濾光片或在520毫微米波長下讀取光密度（或透光率）。以NaNO2濃度為橫座標、光密度為縱坐標繪制光密度－濃度標曲線。
3．NO2－含量測定：將吸取的測定樣品1 ml 置于一試管中，加入磺胺試劑及α－萘胺試劑各2 ml ，混合搖勻，靜止30分鐘（于30℃溫箱中）后立即比色測定：在520毫微米下讀取光密度。對比標準曲線，查出NO2－的含量。然后計算酶活性：以每小時每克鮮重產生的NO2－的微摩爾（μM ）值表示。 展開 |
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