硝酸還原酶活性的測定實驗

實驗方法原理 硝酸還原酶是植物氮素代謝作用中的關鍵酶，與作物吸收和利用硝態氮的能力相關。它催化NO3－還原為NO2－的反應：

NO3－+NADH+H+→NO2－+NAD++H2O

反應產生的NO2－可從組織內滲透到外界溶液中，定時測定一定的反應溶液中NO2－含量的變化情況則可了解此酶的活性大小。NO2－的定量測定是用磺胺比色法。此法簡單易行而又非常靈敏，可測出0.5微克/  ml NaNO2含量的變化。

試劑、試劑盒 磷酸緩沖液KNO3溶液磺胺試劑α－萘胺試劑 NaNO2標準溶液

儀器、耗材 721型分光光度計真空泵保溫箱天平真空干燥器打孔器三角瓶移液管燒杯

實驗步驟

一、材料和設備

蓖麻、煙草、向日葵、油菜、小麥或棉花的葉片。

721型分光光度計、真空泵（或注射器）、保溫箱、天平、真空干燥器、打孔器、三角瓶、移液管、燒杯

藥品

0.1 M 磷酸緩沖液（pH7.5）

0.2 M KNO3溶液

磺胺（對氨基苯磺酸胺）試劑：1克磺胺溶于25毫升濃鹽酸后再用蒸餾水稀釋至100 ml 。

α－萘胺試劑：0.2克α萘胺溶于25 ml 濃鹽酸中，再用蒸餾水稀釋至100 ml 。

NaNO2標準溶液：1克NaNO2溶于1000  ml 蒸餾水中配成NaNO2母液。實驗時按處理稀釋成要求濃度。如1微克/ ml ：取母液1 ml ，用蒸餾水稀釋成1000 ml 。

二、實驗步驟

1．將新鮮取回的材料葉片用水清洗后用吸水紙吸干水份。用打孔器取下直徑為1厘米的園片，再用蒸餾水洗2－3次，將蒸餾水吸干。在天平上稱取等重的葉子園片兩份：每份0.4克左右（或每份取50個園片）。將兩份園片分別置于下列兩種溶液中，容器使用50  ml 三角瓶。

（1）0.1 M 磷酸緩沖液5 ml +蒸餾水5 ml 。

（2）0.1 M 磷酸緩沖液5 ml +0.2 M KNO3溶液5 ml 。

將三角瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽氣，使園片沉于瓶底（也可將園片置于注射器中抽氣）。將三角瓶置于30℃溫箱中（黑暗）保溫30分鐘，然后分別取兩種溶液各1  ml ,準備測定NO2－含量。

（注意取葉前葉片要進行過一段時間的光合作用。若組織中碳水化合物含量降低使此酶的活性降低。當組織內含糖量低時，可在反應液中加入30μ M  3－磷酸甘油醛或1，6－二磷酸果糖，可顯著增加NO2－的產生）。

2．繪制標準曲線：磺胺比色法可測出低于1微克/  ml 的NaNO2含量。在0－5微克/  ml 濃度范圍內繪制標準曲線。顯色反應的速度與重氮化作用的速度及偶聯反應的速度相關，因此受溫度、酸堿度等影響，也造成靈敏度的變化，若標準樣品與測定樣品在相同條件下測定，則顯色速度也相同，可以作比較。

吸取不同濃度的NaNO2溶液各1 ml 于試管中，（設置NaNO2溶液處理可為5、4、3、2、1、0微克/  ml ）加入磺胺試劑2  ml 及α－萘胺試劑2 ml ，混合搖勻。在30℃溫箱中保溫30分鐘后立即于比色計上比色，用50號濾光片或在520毫微米波長下讀取光密度（或透光率）。以NaNO2濃度為橫座標、光密度為縱坐標繪制光密度－濃度標曲線。

3．NO2－含量測定：將吸取的測定樣品1 ml 置于一試管中，加入磺胺試劑及α－萘胺試劑各2 ml ，混合搖勻，靜止30分鐘（于30℃溫箱中）后立即比色測定：在520毫微米下讀取光密度。對比標準曲線，查出NO2－的含量。然后計算酶活性：以每小時每克鮮重產生的NO2－的微摩爾（μM ）值表示。