疊皿夾層法實質是將菌夾在上下兩層培養基之間，使其造成一個相對無氧的環境，從而使SRB能在夾縫中生長。
具體做法是將已經富集好的菌液采用無菌操作技術稀釋成不同濃度。將含有質量分數為2%瓊脂的固體培養基熔化并保持在50℃左右，在無菌條件下，向培養皿（90mm×15mm）的皿蓋中倒入約1/3高度的固體培養基，待其剛剛冷凝后，將不同濃度的稀釋液吸取適量，快速涂布平板上，使稀釋液滲透約30s后，在培養皿的中間位置倒入同種營養型固體培養基，直到將溢未溢的突起狀態，隨后迅速蓋上皿蓋并往下壓，最終皿內不能有氣泡。
去掉培養皿內外兩層側壁間多余的瓊脂，并在其中灌入適量熔化的石蠟，使培養皿側壁縫隙被石蠟密封，盡量不要留有氣泡。培養一周后，在加有二價鐵離子的平板中會長出黑色的SRB菌落，在酒精燈旁加熱使固體石蠟熔化，由于上下兩層培養基凝固時間不同，所以當移去內皿后，用鑷子很容易將上層培養基揭起，從而露出下層培養基的菌落。當需要進行菌落挑取時,可以對其進行切塊轉移，放入液體培養基時搗碎即可。
該方法的優點是培養物均采用涂布或劃線生長于營養瓊脂夾層中，取菌落時可很方便地做到定點取菌，同時該方法不需要另外創建一個無氧環境，故省時、省力，具備了所有好氧、厭氧分離方法的優點。