堿性磷酸酶標記試劑的使用

實驗概要

本實驗介紹了堿性磷酸酶標記試劑的使用方法。BCIP／NBT是堿性磷酸酶最常使用的呈色底物，堿性磷酸酶標記的試劑應該用真核生物的堿性磷酸酶，因為這種酶容易被EDTA滅活。細菌酶難以終止其活性，易引起顯色過度，導致較高背景。

BCIP／NBT底物在酶結合位點形成強烈的黑紫色沉淀，此反應是一個穩定進行的過程。因此，可設定一個精確的反應對照。可以通過孵育時間的長短控制反應的敏感性。

主要試劑

堿性磷酸酶緩沖液：100mmol／L NaCl，5mmol／L MgCl₂，100mmol／L Tris(pH9.5)；

NBT溶液(0.5gNBT用10ml 70％DMF溶解，貯存在4℃)；

BCIP溶液(0.5gBCIP[二鈉鹽]用10ml100％DMF溶解，貯存在4℃)；

20mmol／LEDTA用PBS溶解，DPX。

主要設備

光學顯微鏡(通常帶有照相機以便于記錄結果)

實驗步驟

1. 細胞染色前，準備3種貯存液：

   1) NBT：用10ml 70％DMF溶解0.5gNBT；

   2) BCIP：用10ml 100％DMF溶解0.5g BCIP[二鈉鹽]；

   3) 堿性磷酸酶緩沖液：100mmol／LNaCl，5mmol／LMgCl₂，100mmol／LTris(pH 9.5)。所有的貯存液置4℃可保存1年。

2. 實驗前，底物液新鮮配制。加66ul NBT貯存液至10ml堿性磷酸酶緩沖液中，充分混合，加33ul BCIP貯存液，在1h內使用。

3. 將洗滌過的標本片放在一個適當的容器內。加足夠量的底物液覆蓋標本片(3～5ml適合于100mm平皿)。在室溫中進行反應直到染色達到適當黑色。對一些試劑可在顯微鏡下定期監測。一般孵育時間大約是30min。

4. 在含有20mmol／LEDTA的PBS中漂洗以終止反應，螯合Mg² 。

5. 優化：如果需要，進行復染。

6. 用水沖洗，DPX封片。