產品簡介：
一基生產的堿性磷酸酶檢測試劑盒(Alkaline Phosphatase Assay Kit)是一種用于快速、便捷地檢測細胞或組織樣品的裂解或勻漿產物的上清液、血清、血漿、尿液等樣品中內源性的堿性磷酸酶活性的試劑盒。
堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, AP/ALP/AKP/ALKP/ALPase/Alk Phos)也稱堿性磷酸酯酶(EC 3.1.3.1)，可以在堿性條件下催化磷酸酯鍵的水解。哺乳動物中，肝臟、膽管、腎臟、骨頭和胎盤中的堿性磷酸酶活性比較高。常見的堿性磷酸酶包括腸
道堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, intestinal, ALPI)、非組織特異性堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, tissue-nonspecific isozyme, ALPL)和胎盤堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, placental type, 也稱placental alkaline phosphatase, PLAP)。常見的小牛腸堿性磷酸酶(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase, CIAP/CIP)被廣泛用于二抗等的標記最終用于蛋白和核酸等的檢測，也常用于DNA或RNA 5′和3′末端的去磷酸化(去單磷酸化)，特別是質粒的5′末端去磷酸化以避免質粒自連等。
干細胞，如iPS中，堿性磷酸酶的活性很高，常被用作iPS成功誘導的標志。另外，分化的結腸癌細胞中堿性磷酸酶的活性也
會顯著升高，被當作結腸癌細胞分化程度定性和定量的指標。此外，血清中堿性磷酸酯酶的升高，被稱作高堿性磷酸酶血癥(hyperalkalinephosphatasemia)，被認為和惡性膽管阻塞(malignant biliary obstruction)、原發性膽管硬化(primary biliary cirrhosis)、原發性硬化膽管炎(primary sclerosing cholangitis)、肝淋巴瘤(hepatic lymphoma)和肝肉瘤(hepatic sarcoidosis)等肝膽
疾病密切相關。血清中堿性磷酸酶活性升高還和骨頭生成密切相關，因為堿性磷酸酶是成骨細胞的副產物。血清中堿性磷酸酶活性過低也和一些疾病相關。兒童和孕婦血清中的堿性磷酸酶活性較普通人高一些。血清中堿性磷酸酶活性范圍在
20-140U/L。
除胎盤堿性磷酸酶(alkaline phosphatase placental isoform)以外，其它的內源性堿性磷酸酶加熱后易失活。
本試劑盒可以檢測細胞或組織樣品的裂解或勻漿產物的上清液、血漿、血清、尿液或純化的酶樣品等中的堿性磷酸酶活性。
Para-nitrophenyl phosphate (pNPP) 是一種常用的磷酸酶顯色底物，在堿性條件下，可在堿性磷酸酶作用下生成para-nitrophenol。para-nitrophenol (p-nitrophenol)在堿性條件下，呈黃色產物，可以在400-415nm檢測吸光度。產物黃色越深，說明堿性磷酸酶檢活性越高，反之則酶活性越低。據此通過比色分析就可以計算出堿性磷酸酶活性水平。
包括標準品和空白對照，本試劑盒共可進行100個樣品的檢測。
包裝清單：
產品編號 | 產品名稱 | 包裝 | ||
P0321-1 | 檢測緩沖液 | 15ml | ||
P0321-2 | 顯色底物 | 2管 | ||
P0321-3 | p-nitrophenol溶液(10mM) | 0.1ml | ||
P0321-4 | 反應終止液 | 12ml | ||
— | 說明書 | 1份 |
保存條件：
-20oC保存，一年有效。其中顯色底物和p-nitrophenol溶液需避光保存。
注意事項：
如果希望進行酶活性的絕對定量，進行酶反應時必須注意精確計時。此時推薦采用孵育30分鐘等較長的時間，以減小操作過程中的時間誤差。同時如果樣品中酶活性較高，則可以預先適當稀釋樣品。
樣品溶液中須避免出現EDTA、氟離子、檸檬酸鹽等堿性磷酸酶的抑制劑。
檢測緩沖液和p-nitrophenol溶液對人體有害，操作時請小心，并注意有效防護以避免直接接觸人體或吸入體內。反應終止液有腐蝕性，操作時請小心，并注意有效防護以避免直接接觸人體或腐蝕其他物品。
本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明：
試劑準備：將所有試劑取出，恢復至室溫使用。
顯色底物溶液：取一管顯色底物，溶解于2.5ml的檢測緩沖液中(可先用1ml檢測緩沖液進行溶解，充分溶解和混勻后，轉移至15ml離心管，再加入1.5ml檢測緩沖液)，充分溶解和混勻，冰上放置。新鮮配制的顯色底物溶液需在6小時內使用。
b. 標準品工作液：取10μl p-nitrophenol溶液(10mM)，用檢測緩沖液稀釋至0.2ml，最終濃度為0.5mM。 | ||||||
2. | 樣品準備： | |||||
a. 細胞或組織裂解液的準備：采用適當細胞或組織裂解液裂解細胞或組織，建議使用一基的P0013J Western及IP細胞裂解 | ||||||
液(無抑制劑)裂解相關樣品。如果有必要需進行適當勻漿，隨后離心取上清，用于堿性磷酸酶的檢測。注意：裂解液中 | ||||||
不能含有磷酸酶抑制劑。樣品可以-80oC凍存，但需避免反復凍融。 | ||||||
b. 血漿、血清和尿液的準備：血漿和血清按照常規方法制備后可以直接用于本試劑盒的測定，但為了消除樣品本身顏色的 | ||||||
干擾，需設置加了血漿或血清但不加底物的對照。血漿制備時不能用含EDTA和檸檬酸鹽的抗凝管。尿液通常也可以直 | ||||||
接用于測定。上述樣品可以-80oC凍存，但需避免反復凍融。 | ||||||
c. 樣品的稀釋：如果樣品中含有較高活性的堿性磷酸酶，可以使用原有的裂解液或PBS等進行稀釋，也可以采用試劑盒中 | ||||||
的檢測緩沖液進行稀釋。如果使用試劑盒中提供的檢測緩沖液進行稀釋，需注意保留足夠的檢測緩沖液用于試劑盒的檢 | ||||||
測過程。 | ||||||
3. | 參考下表使用96孔板設置空白對照孔、標準品孔和樣品孔。標準品的用量分別為4、8、16、24、32和40微升，樣品通常可 | |||||
以直接加50微升。如果樣品中的堿性磷酸酶活性過高，可以減少樣品用量或適當稀釋后再進行測定。 | ||||||
空白對照(Blank) | 標準品(Standard) | 樣品(Sample) | ||||
檢測緩沖液 | 50μl | (100-x)μl | (50-y)μl | |||
顯色底物 | 50μl | － | 50μl | |||
樣品 | － | － | yμl | |||
標準品工作液 | － | xμl | － | |||
4. | 用槍頭輕輕吹打混勻，也可借助搖床進行混勻。 | |||||
5. | 37oC孵育5-10分鐘。(說明：待測樣品中堿性磷酸酶活性較低時，可適當延長孵育時間至30分鐘) | |||||
6. | 每孔加入100μl反應終止液終止反應。此時，標準品或有堿性磷酸酶活性的孔會呈現不同深淺的黃色。 | |||||
7. | 在405nm測定吸光度。如果不能測定405nm，也可以在400-415nm范圍內檢測吸光度。如果不能立即測定，可以在數小時內 | |||||
完成測定，所顯現的黃色在數小時內穩定。 | ||||||
8. | 堿性磷酸酶活性單位的定義：在pH9.8的diethanolamine(DEA)緩沖液中，37oC條件下，每分鐘水解para-nitrophenyl phosphate | |||||
顯色底物產生1微摩爾p-nitrophenol所需的堿性磷酸酶的量定義為一個酶活力單位，也被稱作一個DEA酶活力單位。在pH9.6 | ||||||
的甘氨酸緩沖液中，25oC條件下，每分鐘水解para-nitrophenyl phosphate顯色底物產生1微摩爾p-nitrophenol所需的堿性磷酸酶 | ||||||
的量定義為一個酶活力單位，也被稱作一個Glycine酶活力單位。一個Glycine酶活力單位約相當于3個DEA酶活力單位。本試 | ||||||
劑盒測定的是DEA酶活力單位。 | ||||||
9. | 根據酶活性定義，計算出樣品中的堿性磷酸酶活性。 |
堿性磷酸酶檢測試劑盒 | ||||
產品編號 | 產品名稱 | 包裝 | ||
YJ0321 | 堿性磷酸酶檢測試劑盒 | 100次 |