磁珠法提純mRNA

實驗概要

真核細胞的mRAN是單順反子，其最顯著的特征是具有５'端帽子結構和3'端的poly A的結構，此poly A結構為mRNA的提取提供了有效的途徑，人們利用堿基配對原理，采用寡聚Ｔ結構作為親和柱材料，當含mRNA的總RNA樣品流經寡聚Ｔ柱時，mRAN即被特異性的結合到柱上，從而可與其它RNA相分開，這就是寡聚(dT)纖維素或寡聚(U)瓊脂糖親和柱分離mRAN的原理。目前雖然mRNA的提取已有多種方法，如超速離心法、免疫法，但較常用的、簡便的方法還應是柱層析法。不過近幾年，mRNA的提取方法又有所改進和突破，mRNA的磁珠分離即是這些新方法中的一類主要技術。該技術建立于３類強有力的相互作用上，即A與T堿基間的強配對性；鏈菌素抗生物素與生物素間的強免疫作用及稀土元素磁鐵與順磁性物質間的強磁性作用。mRNA的磁珠分離技術提取mRNA的原理主要為用生物素標記的Oligo(dT)與mRNA3'端的poly A退火形成雜交體，然后用帶有親和素(鏈菌素抗生物素)的順磁磁珠洗滌并捕獲雜交體，形成雜交體－磁珠復合體，最后用磁架將此復合體捕獲，這樣mRNA即可與其它形式的RNA相分開，進一步用無RNase無菌水洗滌，即可獲得純化的mRNA。

實驗原理

主要試劑

mRNA 分離系統試劑盒，異丙醇，3MNaAC

主要設備

水浴，離心機，取液器，分光光度計

實驗步驟

1. 生物素標記的Oligo(dT)探針與mRNA的煺火

   1) 在DEPC處理過的1.5mlEppendof管中，加入0.2-1mg的總RNA和無RNase的水至終體積為0.5ml。

   2) 65℃加熱10min.

   3) 加入2μl生物素標記的Oligo(dT)探針和12μl的20×SSC于RNA中輕輕混勻，室溫放置，逐漸冷卻平衡至室溫，此步操作一般需10min。

2. 親和素順磁磁珠（SA-PMPS）的沖洗

   1) 將SA-PMPS輕晃開后，放入磁性分離架中，使SA-PMPS集中于試管一則(約30秒)，小心去除上清（不用離心方法）用1.5ml0.5×SSC漂洗SA-PMPS，用磁性分離架集中磁珠，去除上清，漂洗3次。

   2) 將漂洗過的SA-PMPS重新懸浮于0.2ml0.5×SSC中。

3. 雜交體的生成及漂洗

   1) 將上步"３"中褪火的生物素標記的Oligo(dT)探針，全部加到上步"5"管中，輕輕混勻，室溫放置10min。每隔2分鐘輕輕混勻一次。

   2) 用磁性分離架捕獲磁珠，吸棄上清。

   3) 用0.3ml0.1×SSC漂洗SA-PMPS，用磁性分離架集中磁珠，吸棄上清，漂洗4次。

3. 洗滌收集mRNA

   1) 將漂洗過的SA-PMPS重新懸浮于0.2mlDEPC水中。

   2)用磁性分離架捕獲磁珠，將洗脫的水相吸至一新管中。重復洗滌一次，吸取水相，兩次水相合并(約0.25ml)。

   3) 在洗脫液中加入0.1體積的NaAC，1體積的異丙醇，－２０℃沉淀過夜，12000g 離心10min，75%乙醇洗沉淀，真空干燥。

   4) 提取mRNA質量的分光光度計檢測，將所提mRAN分別在260，280nm比色，要求A：OD260％/ OD280％不小于2.0及40μg所提樣品在OD260％的值為1 。

   5) 提取mRNA質量的電泳檢測，在1%的變性膠上，EB染色后，mRNA應在0.5-8Kb間均勻著色，1.5-2Kb間著色較強。

附    件   (共1個附件,占29KB)

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