磷酸化位點分析實驗確定磷酸化氨基酸類型

蛋白樣品

了解肽或蛋白質中磷酸化氨基酸的類型，可以限定可能的磷酸化位點，并因此簡化(對多肽鏈中磷酸化殘基的確認。磷酸化殘基類型通常由磷酸氨基酸分析或磷酸氨基酸特異性免疫檢測確定。磷酸氨基酸分析是對肽鍵進行氣相或液相水解，此水解條件下要至少保留一段磷酸酯鍵完整。 ³²p標記的磷酸蛋白質或磷酸肽的水解產物與磷酸氨基酸標準品混合，并用TLC 分離。未標記的標準品由茚三酮染色檢測。32p標記氨基酸由放射自顯影檢測。蛋白質中存在的磷酸氨基胺類型通過染色標準品與放射標記種類的相關分析確定。如果能得到大量樣品．磷酸氨基酸類型可以通過茚三酮染色直接確定。用 2D-PP 圖譜上提取的磷酸肽進行磷酸氨基酸分析尤其有用．因為這些肽段通常只含有一種磷酸氨基酸類型。了解磷酸化氨基酸的性質及其他參數，例如肽段分子質量，裂解蛋白質所用的酶的特性，在某些情況下可以鑒定或至少可以推測蛋白質中的磷酸化位點。利用特殊磷酸氨基酸的抗體特異性可以確定地鑒別磷酸化氨基酸的類型，但是這種方法井不能代替磷酸氨基酸分析。酪氨酸磷酸化蛋白質經凝膠分離后很容易通過與酪氨酸磷酸鹽抗血清的免疫印記實驗檢測，抗血清包括 4g10和 py20, 也有如 RC10 一樣的細菌片段抗體。