實驗方法原理
即使納噴 MS/MS 技術已經成功用于直接分析蛋白酶解產生的磷酸肽但是出于以下一些原因，通常建議在質譜分析前作一些分離：
(1) 磷酸肽在蛋白酶切產物中通常只占少數因此容易淹沒在低率度離子產生的總背景中，肽分離技術可濃縮分析物，因此會提高信噪比。
(2) 如果磷酸肽被放射性標記并具有相同比活度，那么每一個被分離的肽段相應的活度計數就表明這一組分中磷酸肽的相對量，，如果已知所用放射性標記物的比活，就能容易地算出磷酸肽的絕對值。
(3) 放射性標記的磷酸肽的分離譜可以用來定量檢測不同時間或細胞肽態下蛋白質磷酸化肽態的變化。
(4)肽分離方法也有效地除去了非肽類雜質，更有利于檢測和分析低豐度磷酸肽。
在現有的分離技術中，2D-PP, RP-HPLC,高分辨凝膠電泳和固相化金屬親和色譜(immobilized metal affinity chromatography, IMAC) 被優先選擇用于分離磷酸肽，雖然要闡明一個明確的策略用于鑒定所有磷蛋白很困難（圖 5.5), 但做一個一般性策略的論述還是有價值的。但即使是圖 5.5 策略中的內容也沒有包含所有可能的途徑。任何一個鑒定方案的細節都與許多因素相關，例如個人對檢測和分離模式的喜好，可得到的樣品及可用的儀器。但總規則是先要得到序列信息，可通過 MS 或 MS/MS方法對體外 2D-PP上的點直接分析，兩者都能得到有用的信隊如果某些點或全部點的序列分析不成功，那么重新水解蛋白質，肽段經 HPLC 分段收集，然后用 MS/MS 分析含32p的組分，可用自動或直接分析方法。如果由于 MS 信噪比糟糕而不能得到 2Dpp 上的點的序列信息，那么 HPLC 收集的組分本質上會更干凈，也許會得到好的數據。如果磷酸化的化學計量值非常低，這種 HPLC 制備方法也許會失敗，可能會觀察到磷酸肽，但是柱上濃度會很低．以致不能產生可用于解析的碎片離子；這種情況下再重復水解蛋白質，用IMAC 富集磷酸肽，用 lMAC 的收集組分做 MS/MS 實驗。不管第一步使用了什么方法，通常從蛋內點到蛋白水解這一步都要進行多次重復，直到所有感興趣的磷酸肽都被測序。要記住，某些肽序列不會以易于解析的方式斷裂，為了測量確切的磷酸化位點，有必要使用合成肽。這一標準品用于比較研究以證實確切的磷酸化位點。當 32p不能摻入蛋白質時，要用下面提到的診斷離子掃描來檢測用于序列分析的磷酸肽。這里提到的及圖 5.5 所示的每一個分離技術都與下面提到的肽的進一步化學、酶及質譜分析方法相適用。
實驗材料 蛋白樣品
實驗步驟
在 2D-PP 譜中，肽段的 4維分離是在薄層纖維板上進行電泳，二維分離是在相同的板上進行薄層色譜已分離到的磷酸，肽經放射自顯影或瞬儲屏檢測。放射自顯影看到的點的數目可用來估計磷酸化位點的最大數目，點的強度可用來指示肽之間磷酸化的相對化學計量值。此外，即使并非能夠分辨所有的肽但樣品中每一個磷酸肽都被計數。觀察到的點的數目沒必要與磷酸化位點的數目直接相聯系，因為磷蛋白中經常可觀察到不完全的蛋白水解。但2D-PP 圖譜也提供了從其他方法中得不到的有關蛋白質磷酸化位點的重要信息，包括：
(1) 磷酸化位點的最大數目。由于蛋白酶水解差異，譜圖產生的點通常多于磷酸化位點。
(2) 放射自顯影強度提供了在所有磷酸肽中磷酸化的相對化學計量。
(3) 電泳和 TLC 的正交分離提供了磷酸肽之間親水性的相對肽態，2D-PP 作圖的另一個優點是能產生純化的磷酸肽，從平板上提取時可用 MS 分析, 如果試圖用 2D-PP 作圖法作為 MS/MS 分析的樣品制備方法，那么所加蛋白酶的量要少，只要能發揮作用即可。 如使用過量的蛋白酶，在 MS 分析磷酸肽時，蛋白酶的自切產物會占據圖譜的主導，抑制了磷酸肽的分析。此外， 2D-PP 作圖法的靈敏高且重現性好．因為檢測磷酸肽是通過整合相當長時間內的放射性衰變，所以方法非常靈敏，并且靈敏度只依賴于放射性標記物的比活。 2D-PP 所獲得圖譜的高度重現性使其被選擇用于分析不同環境，例如不可時間過程，不同活性誘導肽態下蛋白質的磷酸化狀態。