磷酸酶制備實驗

細胞

緩沖鹽清洗液 抽提緩沖液

一、組織/細胞制備和提取

1. 配制下列溶液：

(1) 緩沖鹽清洗液：

20 mmol/L 的 MOPS 緩沖液，pH 7.5（配成 100 ml）

5 mmol/L 的 EDTA

5 mmol/L 的 EGTA

120 mmol/L 的 NaCl

(2) 抽提緩沖液

20 mmol/L 的 MOPS，pH 7.5（配成 10 ml）

5 mmol/L EDTA

5 mmol/L EGTA

60 mmol/L 的 β-巰基乙醇 (1:250 原液）

10% 甘油加

新鮮加入的 1 mmol/L PMSF，PMSF 在異丙醇中制成 100 mmol/L 的儲存液。

2. 準備細胞或組織

(1) 對于培養細胞

① 除去絕大部分的培養基，直接把培養容器（培養皿或培養瓶）放在冰上以冷卻組織培養細胞。

② 用 5 ml 冰冷的緩沖鹽洗滌液沖洗培養容器兩次，倒掉洗液，加入 1 ml 洗液用橡皮細胞刮把細胞收集到 1 ml 清洗液中。

③ 在一個微型離心機中以 2000 g，離心懸液 2 分鐘，收集細胞，倒掉上清。

④ 在 1 ml 的冰冷抽提緩沖液中懸浮沉淀的細胞，然后，在中等強度下超聲處理 30 秒。在微型離心機中以 13000 g，將超聲物高速離心 5 分鐘。

(2) 對于組織樣本

① 把切取的動物組織放到塑料袋中，完全浸泡于冰水中徹底冷卻樣本 5 分鐘。

② 用剪刀把組織（1~2 g ) 切成碎片，每克組織混懸于 1 ml 的組織抽提緩沖液中。

③ 用一個 Polytron (Biinkmaim) 或者 Teflon-玻璃勻漿器勻均組織，并且以 13000 g 離心 10 分鐘。

3. 保存上清液或細胞漿（第 2 步）作為分離 PP-1 和 PP-2A 的啟始材料。用去污劑抽取顆粒部分以分離 PTPase。

二、用連續層析分離 PP-1 和 PP-2A

細胞漿通過 DEAE-Sepharose 以結合 PP-1 和 PP-2A，然后用氨基己基（AH) Sepharose 把 PP-2A 與 PP-1 分離。下面的步驟適合于 0.25 ml 的 DEAE 小珠。

1. 準備層析緩沖液

層析緩沖液：

20 mmoI/L 的 MOPS，pH 7.5 ( 制備 500 ml )

1 mmol/L 的 MgCl₂

60 mmol/L 的 β-巰基乙醇

10% 甘油

2. 用層析緩沖液平衡 DEAE-Seplwose（Phamacia）至 pH 7.5，用洗脫緩沖液（0.5 mol/L 的氯化鈉）平衡 AH-Sepharose (Pharmacia)。

3. 在一個有扣蓋或螺旋蓋的密封小管中將每毫升上清液與 0.25 ml 平衡好的 DEAE-Sepharose 混合，在冰箱中翻轉樣品液 30 分鐘。

4. 準備一個兩腔的裝置，上層濾膜用來滯留珠狀介質，但允許緩沖液在離心過程中穿過，進入底部接收器。

5. —分鐘離心沉淀 DEAE，然后用吸管吸出上清棄去。

6. 用 0.5 ml 的層析緩沖液清洗 DEAE 小珠 3 次，用低速離心（2000 r/min) 使液體與小珠分離。

7. 用 0.5 ml 的洗脫緩沖液（0.5 mol/L 的氯化鈉）從 DEAE中洗脫磷酸酶，在溶液中懸浮小球，然后在新試管中收集洗脫物。

8. 為了從 PP-2A 中分離 PP-1，把來自于 EDAE 的洗脫液直接與 0.25 ml 的 AH-Sepharose(Phamiacia) 混合，翻轉混合 15 分鐘。

9. 過濾 AH-Sephrose，從非結合部分回收 PP-1；PP-2 仍結合在 Sepharose 中。

10. 用 1.0 ml 的洗脫緩沖液（0.5 mol/L 的氯化鈉）洗滌 AH-Scpharose，用 0.5 ml 洗脫緩沖液（1.5 mol/L 的氯化鈉）從 AH-Sepharose 中洗脫 PP-2A。

11. 在 100 ml 量筒中透析含有 PP-2A 的混合洗脫液，透析液用 50 ml 的層析緩沖液（用 2-巰基乙醇制成 150 mmol/L)，加 50 ml 的甘油（保持冰冷漿狀），用窄的透析袋（SpectraPor，7.6mm，12000 分子量截留，可從 Fisher、VWR 等供應商處獲得），用封口膜封緊量筒，用手慢慢上下轉動 15 分鐘，然后放許冷處至少 2 小時。