實驗方法原理 4-α-D-葡聚糖:正磷酸-α-D-葡萄糖基轉移酶。
酶斷裂多糖的α-1,4-糖苷鍵:
(葡萄糖)n+Pi →(葡萄糖)n-1+葡萄糖-1-P
實驗中反應與葡萄糖磷酸變位酶偶聯:
葡萄糖-1-P → 葡萄糖-6-P
并且 6-磷酸葡萄糖脫氫酶催化:
葡萄糖-6-P+NADP+ → 葡萄糖酸-6-P+NADPH+H+
實驗材料 磷酸酶 a
試劑、試劑盒 磷酸鉀EDTA糖原葡萄糖磷酸變位酶 6-磷酸葡萄糖脫氫酶
儀器、耗材 分光光度計
實驗步驟
實驗所需「試劑」具體見「其他」
0.98 ml 實驗混合物
0.02 ml 酶樣品
25 ℃ 時,于 340 nm 處吸收值降低,ε340=6.3×103 l/(mol·cm)。
注意事項
其他
試劑:
0.05 mol/L 磷酸鉀,pH 6.8
0.01 mol/L EDTA(Mr=292.3,29.2 mg 溶于 10 ml 水中)
糖原(60 mg 溶于 10 ml 水中)
1 mmol/L 1,6-二磷酸葡萄糖(脂鯉環己基銨鹽,Mr=736.8;7.4 mg 溶于 10 ml 水中)
0.01 mol/L NADP(Mr=787.4;79 mg 溶于 10 ml 水中)
1 mol/L MgCl2(Mr=203.3,六水合物,2 g 溶于 10 ml 水中)
葡萄糖磷酸變位酶 100 U/mg(100 U/ml 溶液)
6-磷酸葡萄糖脫氫酶,200~400 U/mg(300 U/ml 溶液)。兩種酶在使用之前,都要用游離的銨鹽制備。如果外加了硫酸銨懸浮液,在用前必須用 0.05 mol/L 磷酸鉀 pH 6.8 透析。