神經細胞培養基總結2

許多PNS類型的神經元在離體狀態時表現出簡單的營養需求，只需提供單一的營養因子就足以使其在低密度時增殖。例如，大鼠交感神經元僅需NGF即能存活，在其生存期間，這些神經元可在嚴格局限條件下生長好幾個月（即在無血清培養基中、或缺乏膠質細胞、或在化學限定基質上）。有證據表明NGF是活體中交感神經元存活的生理調節因子。然而，交感神經元也對來自膠質細胞的神經營養因子（GDNF）有反應，還有NT3、LIF與 CNTF也對其有作用。在不產生GDNF或NT3的動物中，交感神經元會有損傷。在離體與活體營養需求之間的差別或許可以用在不同環境中NGF含量和分布的不同來解釋，培養中的NGF彌散在整個環境中，而在活體內，大部分區域的含量是有限的。因此，NGF的重要性在于其合適的濃度。盡管在大多數實驗中已經習慣了營養因子的最大效應使用量，其他營養因子的協同效應在亞優劑量下更容易觀察到。此外，高濃度的營養因子可使細胞更能抵抗毒劑以及其他壓力。相應的，低濃度的營養因子可能用來檢查表現型，例如對自由基或氨基酸的毒性刺激劑量的反應。有許多其他的PNS培養系統只需單一營養因子就可使有實用價值的細胞保持在一定比例，廣為人知的有雛雞睫狀自主神經節神經元和大鼠背根神經節感覺神經元。不過，這些模型也有局限性。例如，培養中的睫狀神經節的神經元加入 CNTF時，超過90%的神經元能存活一個很長時期，但并未有跡象表明它屬于內源的靶細胞來源的營養因子，而是有爭論的相關分子，GPA，扮演了這一角色。大鼠背根神經節含有好幾種細胞群體，其中小細胞群、包括nocioceptive cell，對NGF有反應，但其他神經元，例如大細胞群中的proprioception 卻對不同的神經營養因子有反應。因此，在大多條件下培養物的生長并不能忠實反映親代群體的所有特性，這一問題在CNS的細胞培養中特別突出，因為已有的經驗表明，沒有一種培養基能適合于所有類型及亞類的神經細胞的生長。
現有的證據已表明，CNS神經元的營養需求比PNS的更復雜。對脊髓運動神經元與視網膜節細胞神經元的研究表明，這些神經元與外周神經元相比能對更為廣泛的營養因子起反應。例如，至少發現了 15種不同的分子可在離體條件下增加神經元的存活。而且，已觀察到運動神經元與視網膜對任何單獨的營養因子的存活反應，與PNS中所觀察到的典型反應相比，都要小得多。因此，大多數影響運動神經元及視網膜節細胞的營養因子僅僅只能支持神經元的亞群，而神經元的最佳存活要求諸多因子的結合。在視網膜節細胞的培養中，因子的最佳組合（如BDNF、CNTF、IGF、bFGF）包括了來自不同生長因子家族的代表。這一結果的普遍性尚待進一步的證實，但敲除單一的營養因子基因之后，沒有表現出對CNS大多類群的神經元的存活產生太大影響，這一觀察與上述的事實是一致的。現已知少突膠質細胞的長期存活也需要眾多營養因子的相互作用。

抗生素

在細胞培養中最常用的抗生素是青霉素（常用濃度是25~100ui/ml）與鏈霉素（25~100μg/ml）。這兩種抗生素常混合使用。在一些實驗室里，它們常規加入所有的培養基中。慶大霉素（10~100μg/ml）通常有廣譜抗菌效應，并具有溶液穩定性，故也被一些實驗室使用，特別是當有低水平的污染存在時更是這樣。以上這些試劑對霉菌與酵母菌的污染均無效。
盡管很多實驗室在細胞系的培養基中常規加入抗生素作繼代培養，但仍建議不要在原代培養中加入抗生素，其理由之一是獲得的細胞是無菌的，原代培養時的細菌污染很少發生。其次，盡管認為抗生素對細胞代謝的影響可忽略，但最好避免使用它們，以免細胞生長環境的不穩定。最重要的是要意識到培養中主要污染物的類型，它們通常暗示了問題的來源。

抗有絲分裂劑

某些DNA合成抑制劑對分裂細胞有毒，但對沒有DNA合成的細胞僅有輕微影響。由于神經元通常缺乏DNA合成能力，因此對抗有絲分裂劑沒有多大反應。這樣的試劑常常用于神經元的培養，以消除或減少非神經元群體。若要殺死所有的非神經元細胞，可以先加入血清或生長因子來保證有高比例的非神經元細胞進行DNA合成，此時再加入抗有絲分裂劑。但是，某些細胞在它的細胞周期的某些時相時對抗有絲分裂劑是不敏感的。不過，可以重復的將抗有絲分裂劑使用于增殖的細胞群體。在CNS神經元的培養中抗有絲分裂劑常常在星形細胞形成單層后加入，此時，星形細胞由于接觸抑制而終止了DNA的合成（即細胞停止增殖），它們不會因抗有絲分裂劑的加入而死亡。原代培養中用這種方法阻止成纖維細胞的過度增殖是十分必要的。有兩種抗有絲分裂劑常用于神經元的培養：Fluorodexyuridine，是胸苷合成酶抑制劑，一般使用濃度為～10μM。尿苷（10μM）也常使用，可阻止不分裂細胞的RNA合成。另外，阿糖胞苷也常被使用，其使用濃度為5～50μM。使用任何一種抗有絲分裂劑，都必須考慮它的神經原毒性，應該確定最低效應的使用濃度。阿糖胞苷在很低的濃度下，也會對某些種類的神經元有毒性，可以造成特定神經原的死亡。其他的抗有絲分裂劑尚未表現出這種毒性。

培養的保持

培養物是應該保持在孵箱中的。孵箱可以自動將O2與CO2混合很快達到培養基的設計要求，空氣中的氧濃度比血液和腦脊液中要高得多。對于某些細胞的生長，包括神經原，應使氧含量處在一個較低的水平。可以用孵箱達到這個標準，但這樣的孵箱并未廣泛使用。
高濕度可避免培養皿中培養基的蒸發，保持孵箱中的濕度通常是在箱底部放上一大盆水，這水應該經常換，乘水容器應經常消毒以防霉菌生長。若孵箱曾被霉菌孢子嚴重污染過，那么要想完全去除污染則會非常困難。當培養物必須要長期保持在孵箱中時，應采用較少培養基的瓶、皿，且將蓋子蓋緊以避免蒸發，或采用相應的按比例供空氣的孵箱。
溫度的精確調節應定期檢查，孵箱溫度常設置為37℃或較低溫度。細胞在低溫時可有較長時間的忍耐限度，但當溫度升至39℃時，幾小時內即死亡。
維持培養物的最佳方案常常改變。例如培養膠質細胞時，要經常換液以使其增殖達到最大。而在培養某些神經原時，則要求盡可能少的換液，神經原在兩次換液之間的條件下長的最好。大腦皮質的培養要求在不換液的情形下維持一個月以上。另一方面，象海馬神經原那樣的細胞，倚賴于條件培養基，若換液太頻繁細胞就會衰退，此時，可采用1/3或1/2換液的方式