神經膠質細胞的培養

  （一）雪旺細胞

       雪旺細胞（Schwann cell，SC）是外周神經系統最主要的膠質細胞，也是外周神經的成髓鞘細胞；它形成髓鞘，或包裹軸突而不形成髓鞘。雪旺細胞的功能極其活躍，一旦神經受損，它能反應性分裂增殖，分泌神經營養因子，產生細胞外基質和細胞粘附分子，對神經元及其軸突起營養和修復作用。近年來的研究表明，雪旺細胞也能促進中樞神經對脫髓鞘損傷的修復，如對脊髓的再生，對視網膜神經節以及對隔-海馬通路再生等。

       1、材料和方法

       雪旺細胞培養取材于各類哺乳動物的外周神經和背根神經節，取孵化8-12d雞胚、出生1-3d 的小鼠或大鼠和人工流產的人胎兒，在無菌條件下用解剖鑷分離出神經節，剝除神經節被膜, 用0.125%胰蛋白酶消化(37℃ 30min)后用培養液（ 90% DMEM，10 % 胎牛血清，2mM谷氨酰胺）吹打分散成細胞懸液，先接種于玻璃培養瓶中，于二氧化碳培養箱中孵育30 min后，翻轉瓶子吸出細胞懸液，除去已貼壁的成纖維細胞，再接種于涂有鼠尾膠的35mm塑料培養皿中，種植密度為0.2×105個細胞/ml，每皿2ml細胞懸液置。置二氧化碳培養箱中培養。接種第3 d，在培養皿中分別加入細胞分裂抑制劑5-氟-2'-脫氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml，以進一步去除成纖維細胞，作用48小時后更換新鮮培養液，以后每周換液兩次，每次更換一半新鮮飼養培養液。

       2、雪旺細胞的生長和形態特征

       培養15d后可獲得較高純度的雪旺細胞，雪旺細胞呈雙極梭狀，核卵居中，相互平行排列，經S-100免疫組織化學染色呈陽性反應。增殖分裂的雪旺細胞可用于進一步傳代培養，也可進行冷凍保存備用。

     （二）星形膠質細胞

       星形膠質細胞是膠質細胞中體積最大，數量最多的一種，胞體呈星形，核大，呈卵圓形，染色質稀少，星形膠質細胞分兩類，一類為原漿性星形膠質細胞（protoplasmic astrocyte），其突起短粗，分枝多。另一種為纖維性星形膠質細胞（fibrous astrocyte），它的突起細長，分枝少。纖維性星形膠質細胞是與少突膠質細胞源自同一前體細胞。星形膠質細胞具有多種功能，中樞神經系統內神經元及其突起間的空隙幾乎全部由星形膠質細胞充填，起結構的支持作用，星形膠質細胞的突起構成血腦屏障，星形膠質細胞能攝取和代謝某些神經遞質如γ-氨基丁酸等。

     （1）方法和結果

       選擇出生 2 d 的SD大鼠，無菌條件下分離出大腦皮層，用0.125%胰蛋白酶消化(37℃ 30min)后用培養液（ 90% DMEM，10 % 胎牛血清，2mM谷氨酰胺）吹打分散成細胞懸液，先接種于玻璃培養瓶中，于二氧化碳培養箱中孵育30 min后，翻轉瓶子吸出細胞懸液，除去已貼壁的成纖維細胞，再接種于涂有鼠尾膠的75cm2塑料培養瓶中, 種植密度為1×105 個細胞/cm2，每瓶10ml細胞懸液置。置二氧化碳培養箱中培養。每周換液2 次，培養10-14h，細胞分為兩層，下一層為I型膠質細胞即原漿形膠質細胞，上一層是O-2A前體細胞，根據兩類細胞貼壁能力的差異，以振蕩培養技術進行分選，在37℃搖床上振蕩，16 h（180r/min）O-2A前體細胞可被搖下來，搖下來的細胞種植在涂有鼠尾膠的75mcm2塑料培養瓶中，培養液使用20 % 胎牛血清促進O-2A前體細胞分化為II型膠質細胞即纖維型膠質細胞。可分裂增殖的原漿形膠質細胞和纖維型膠質細胞可用于進一步傳代培養，也可進行冷凍保存備用。純度鑒定可用膠質纖維酸性蛋白抗體（GFAP）染色確定。