實驗概要
本實驗用福林酚法(Folin—酚試劑法)測定了蛋白質的含量。
實驗原理
Folin—酚試劑法最早是由Lowry確定的測定蛋白質濃度的基本方法。以后在生物化學領域得到廣泛的應用。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。這個方法的優點是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點是費時較長，要嚴格控制操作時間，標準曲線也不是嚴格的直線形式，且專一性較差，干擾物質較多。凡干擾雙縮脲反應的基團，如 -CO-NH2, -CH2-NH2, CS-NH2以及Tris緩沖液、蔗糖、硫酸銨、巰基化合物均可干擾Folin—酚反應，而且對后者的影響還要大得多。此外，酚類、檸檬酸對此反應也有干擾作用。
Folin—酚試劑由甲試劑和乙試劑組成。甲試劑由碳酸鈉，氫氧化鈉，硫酸銅及酒石酸鉀鈉組成。蛋白質中的肽鍵在堿性條件下，與酒石酸鉀鈉銅鹽溶液起作用，生成紫紅色絡合物。乙試劑是由磷鉬酸和磷鎢酸、硫酸、溴等組成。此試劑在堿性條件下，易被蛋白質中酪氨酸的酚基還原呈藍色反應，其色澤深淺與蛋白質含量成正比。此法也適用于測定酪氨酸和色氨酸的含量。本法可測定范圍是25—250μg蛋白質。
主要試劑
Folin—酚試劑：
1. 試劑甲
1) 4%碳酸鈉溶液
2) 0.2mol/L氫氧化鈉溶液
3) 1%硫酸銅溶液
4) 2%酒石酸鉀鈉溶液。
臨用前將（1）與（2）等體積配制碳酸鈉—氫氧化鈉溶液。（3）與（4）等體積配制成硫酸銅—酒石酸鉀鈉溶液。然后這兩種試劑按50:1的比例配合，即成Folin—酚試劑甲。此試劑臨用前配制，一天內有效。
2. 試劑乙
稱鎢酸鈉100g，鉬酸鈉25g置2000mL磨口回流裝置內，加蒸餾水700mL，85%磷酸50mL和濃硫酸100mL。充分混勻，使其溶解。小火加熱，回流10h（燒瓶內加小玻璃珠數顆，以防溶液溢出），再加入硫酸鋰（LiSO4）150g，蒸餾水50mL及液溴數滴。在通風櫥中開口煮沸15min，以除去多余的溴。冷卻后定容至1000mL，過濾即成Folin—酚試劑乙貯存液，此液應為鮮黃色，不帶任何綠色。置棕瓶中，可在冰箱長期保存。若此貯存液使用過久，顏色由黃變綠，可加幾滴液溴，煮沸幾分鐘，恢復原色仍可繼續使用。
試劑乙貯存液在使用前應確定其酸度。以之滴定標準氫氧化鈉溶液（1mol/L左右），以酚酞為指示劑，當溶液顏色由紅→紫紅→紫灰→墨綠時即為滴定終點。該試劑的酸度應為2mol/L左右，將之稀釋至相當于1mol/L酸度應用。
主要設備
1. 試管1.5×375px（×6）
2. 試管架
3. 移液管0.5mL（×2）；1mL（×2）；5mL（×1）
4. 恒溫水浴
5. 分光光度計
實驗材料
1. 標準蛋白質溶液
結晶牛血清白蛋白或酪蛋白，預先經微量克氏定氮法測定蛋白質含量，根據其純度配制成150μg/mL蛋白溶液。
2. 待測蛋白質溶液
人血清，使用前稀釋150倍。
實驗步驟
1. 制作標準曲線
取7支試管，按下表平行操作：
試管編號 試劑處理 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
標準蛋白質溶液（mL） | 0 | 0.1 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
蒸餾水（mL） | 1.0 | 0.9 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 0 |
Folin-酚甲試劑（mL） | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 |
搖勻，于20—25℃放置10min | |||||||
Folin- 酚乙試劑（mL） | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
迅速搖勻，30℃（或室溫20—25℃）水浴保溫30min，以蒸餾水為空白， 在640nm處比色。 | |||||||
A640 |
繪制標準曲線：以A640值為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐標，在坐標紙上繪制標準曲線。
2. 未知樣品蛋白質濃度測定
取2支試管，按下表平行操作：
試管編號 試劑處理 | 空白管 ×2 | 樣品管 ×2 |
血清稀釋液 (mL) | 0 | 0.2 |
蒸餾水 (mL) | 1.0 | 0.8 |
Folin－酚甲試劑(mL) | 5.0 | 5.0 |
搖勻，于20—25℃放置10min | ||
Folin－酚乙試劑(mL) | 0.5 | 0.5 |
迅速搖勻，30℃（或室溫20—25℃）水浴保溫30min，以蒸餾水為空白，在640nm處比色。 | ||
A640 |
3. 計算
注意事項
1. Folin-酚乙試劑在酸性條件下較穩定，而Folin－酚甲試劑是在堿性條件下與蛋白質作用生成堿性的銅－蛋白質溶液。當Folin－酚乙試劑加入后，應迅速搖勻（加一管搖一管），使還原反應產生在磷鉬酸－磷鎢酸試劑被破壞之前。
2. 血清稀釋的倍數應使蛋白質含量在標準曲線范圍之內，若超過此范圍則需將血清酌情稀釋。
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