離體葉綠體的制備以及完整度的測定

實驗概要

分離方法一般有兩種，一是酶消化方法，把葉片表皮撕去后，用纖維素酶和果膠酶消化細胞壁，得到原生質體，再把原生質體通過尼龍網小孔(孔徑20μm)，使原生質體破裂而釋放出完整葉綠體，但此方法分離得到的葉綠體數量有限。另一種是用機械方法，先用搗碎機破碎葉片，再分步離心，可以大量制備葉綠體。這里主要介紹離心法分離完整葉綠體。

實驗原理

葉綠體是植物進行光合作用的細胞器，分布在葉肉細胞內（組成氣孔的保衛細胞也含有葉綠體）。葉綠體是由被膜、間質和類囊體三部分組成。依據分離所得葉綠體的結構完整程度，大致將葉綠體分成兩類：一類為被膜已破碎的葉綠體，稱之為破碎葉綠體，它具有光合電子傳遞、光合放氧和光合磷酸化的功能；另一類為被膜完整的葉綠體，它具有同化二氧化碳的完全的光合作用功能。分離和制備有活性的離題葉綠體是研究葉綠體的結構功能、光合作用原理及遺傳控制機理的前提。要分離有活性、較純的完整葉綠體相當困難，有些植物葉片細胞的細胞比較厚，葉綠體不易從細胞中分離出來；有些植物葉綠體外膜極易破損，有些植物葉片細胞中含有某些內源性抑制物質。例如：水解酶、氧化酶等，在制備過程中極易釋放出來，破壞葉綠體的結構和活性。因此，不是所有的高等植物都適合用來分離和制備葉綠體，最常用的植物材料有菠菜、豌豆、玉米、甜菜、大麥等。此外，低等植物如衣藻、小球藻等也是常用的材料。葉綠體遺傳轉化技術作為一項新技術近年來為植物基因工程提供了一條新途徑。但葉綠體一旦離體，其翻譯活性在15～30min   后就可能完全喪失。葉綠體是綠色植物細胞中典型的細胞器，可通過研磨葉片并勻漿后，根據其顆粒大小經過濾、差速離心加以分離。分離葉綠體應在等滲溶液中制備，以減少滲透壓對葉綠體的傷害。整個分離過程應在0~4℃下進行，所有提取物、溶液和材料，也應保存在該溫度下備用。葉綠體活力會隨著離體時間延長而不斷下降，因此，分離工作應盡可能在短時間內完成。

主要試劑

1. 提取液：含0.33mol/L山梨醇，0.05 mol/L MES (pH 6.1)，0.01 mol/L NaCl，2mmol/L MgC1₂，2 mmol/L EDTA-Na₂，0.5 mmol/L KH₂P0₄，2 mmol/L抗壞血酸鈉(抗壞血酸鈉宜在使用前現配現加)
2. 漲破葉綠體的Hill反應速率測定液：0.05 mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，5 mmol/L MgCl₂，10 mmol/L NaCl，10 mmol/L K₃Fe(CN)₆。10 mmol/L NH₄C1
3. 0.66 mol/L山梨醇
 4. Percoll(一種具有高密度和低滲透勢的二氧化硅溶膠)  percoll本身是低滲透壓的，要用高滲透壓溶液配成生理等滲透壓溶液，然后使用，不然，細胞容易破裂。一般是先用9份Percoll與1份8.5％  NaCl或1.5MPBS混合達到生理性滲透壓，然后用生理溶液(0.85％ NaCl或0.15M  PBS)稀釋到所需濃度。即取Percoll原液與10倍濃縮的PBS以9：1的比例混合，此時溶液 為100％  Percoll，比重是1.127，毫克分子滲透壓濃度為290mOsmol/kg。

主要設備

普通離心機(需帶有水平離心頭)，或低溫離心機、電動搗碎器、照光裝置、氧電極測氧裝置等。

實驗步驟

1. 采摘新鮮菠菜或豌豆葉片
  菠菜要選擇嫩而厚，無顯著皺紋的葉片，最好在早晨摘取，以免日照后在葉綠體內積累淀粉，不利于完整葉綠體的分離。豌豆也要選擇嫩而厚的葉片，摘取后應盡快使用。葉片先在強光下照射15～20min，用以激活葉綠體，尤其用在完整葉綠體的以二氧化碳為底物放氧活性測定時，能使其縮短光合作用誘導期。為了防止強光照射下的溫度上升，可把葉片鋪放在冰塊上，并在光源與葉片之間放隔水層。
2. 葉綠體制備
  葉片去除葉柄及中脈后，以每10g葉片約加20～30ml冰冷的提取液。在電動搗碎器上高速搗碎，約2s/次，間隔搗碎3～4次，使葉片碎成綠豆粒樣大小，然后經4層紗布過濾，去除殘渣。注意過濾時不可用力擠壓，以免葉綠體被膜破碎。濾液以1000×g離心，4℃，將離心管放人離心機后，使離心機的加速很快上升到預定值，經約30s后再很快使其下降停止，整個離心程序大約用2～3min左右完成。小心地倒出上清液，先用少許提取介質漂洗去沉淀表面的浮物，再加入懸浮介質：即把提取介質中的MES換成HEPES(pH7.6)，懸浮葉綠體，在分散葉綠體沉淀時宜使用毛筆輕輕刷之，或者用手握住離心管，在冰塊之間攪動，使葉綠體由于振動而分散開來，不要用棉球吸濾，以防被膜壓破。葉綠體懸浮時要濃一些(含葉綠素2  mg/ml以上)，這樣有利于其活性的保持。
3. 葉綠體被膜完整率的進一步提高
 上述方法所得葉綠體被膜完整率一般約在60%左右，好的時候也可達到70%以上。如果需要進一步提純，一種簡單的方法是再次用懸浮介質洗滌葉綠體，并用同樣離心方法沉淀葉綠體，把破碎的葉綠體漂洗去，起著浮選作用，但用此方法提高被膜完整率的程度有限，而且葉綠體損失也多。另一種方法是用Percoll作為密度梯度介質，方法是將3m1含有80%  Percoll(以原液為100%濃度，用水稀釋)，鋪在10ml體積的離心管下層，再把3m1  40%Percoll鋪在離心管的中層，然后將lml葉綠體懸浮液輕輕地鋪在離心管的上層，用水平離心頭的離心機在1500×g下離心2～3min，注意此時離心機的加速一定要緩慢上升，而下降時也要緩慢停下，否則會破壞Percoll的濃度梯度層的形成，取出離心管可以看到有3層綠色帶，最上層的為破碎葉綠體，沉在底層的為粗顆粒，而40%～80%   Percoll之間的界面上有一綠色層，是完整葉綠體，小心地將它吸取出來，轉移到葉綠體懸浮介質里。此部分葉綠體的被膜完整率可達95%以上，有時甚至100%。Percoll介質可以重復使用，把密度梯度離心用過以后的40%和80%   Percoll，分別吸取出來，存儲于冰箱中以備下次使用。如果制備完整葉綠體的目的只是為了供葉綠體DNA的分離所用，則主要獲得被膜完整率高的葉綠體制劑即可，不必考慮葉綠體同化二氧化碳的活性，因此提取介質可改用簡單的STN溶液，但是操作順序需按照制備完整葉綠體的方法，再用Percoll作密度梯度離心提純。

葉綠體被膜完整率的測定：

由于鐵氰化鉀不能透過葉綠體被膜，故完整葉綠體在等滲條件下不能進行鐵氰化鉀光還原的反應，而被膜破碎的葉綠體，鐵氰化鉀可進入葉綠體進行反應，利用此原理來比較被膜破碎與未破碎葉綠體的Hill反應速率的差別，就可測出葉綠體中被膜的完整率。被膜未破的葉綠體的Hill反應速率測定，是將上述被膜漲破葉綠體的Hill反應速率測定液，先以1：1體積與0.66  mol/L山梨醇混合，使之保持0.33  mol/L山梨醇濃度，再加入葉綠體(每毫升反應液約含葉綠素50μg)，用氧電極方法測定Hill反應速率(參閱氧電極測氧方法)。被膜破碎的葉綠體Hill反應速率測定，是先與不含山梨醇的Hill反應液混合，使被膜在低滲介質下脹破，再以1：1體積與0.66mol/L山梨醇混合，使測定時也保持0.33mol/L山梨醇濃度，在相同條件下測定Hill反應速率。被膜完整率的計算如下：
被膜完整率(%)＝[（被膜漲破葉綠體的Hill反應速率－完整葉綠體的Hill反應速率）/被膜漲破葉綠體的Hill反應速率 ]×100
測定計算實例見下圖：

用鐵氰化鉀作Hill氧化劑檢測葉綠體完整度記錄圖

被膜完整率(%)＝(150－8)/150＝94.7%
4. 實驗結果 按照上述的圖表記錄實驗結果并計算。

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