離子交換層析(IonExchangeChromatography,IEC)(1)

簡介
離子交換層析(Ion Exchange Chromatography 簡稱為IEC)是以離子交換劑為固定相，依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。 1848年，Thompson 等人在研究土壤堿性物質交換過程中發現離子交換現象。本世紀40年代，出現了具有穩定交換特性的聚苯乙烯離子交換樹脂。50年代，離子交換層析進入生物化學領域，應用于氨基酸的分析。目前離子交換層析仍是生物化學領域中常用的一種層析方法，廣泛的應用于各種生化物質如氨基酸、蛋白、糖類、核苷酸等的分離純化。
基本原理
離子交換層析是依據各種離子或離子化合物與離子交換劑的結合力不同而進行分離純化的。離子交換層析的固定相是離子交換劑，它是由一類不溶于水的惰性高分子聚合物基質通過一定的化學反應共價結合上某種電荷基團形成的。離子交換劑可以分為三部分：高分子聚合物基質、電荷基團和平衡離子。電荷基團與高分子聚合物共價結合，形成一個帶電的可進行離子交換的基團。平衡離子是結合于電荷基團上的相反離子，它能與溶液中其它的離子基團發生可逆的交換反應。平衡離子帶正電的離子交換劑能與帶正電的離子基團發生交換作用，稱為陽離子交換劑；平衡離子帶負電的離子交換劑與帶負電的離子基團發生交換作用，稱為陰離子交換劑。
其中R 代表離子交換劑的高分子聚合物基質，X-和X+分別代表陽離子交換劑和陰離子交換劑中與高分子聚合物共價結合的電荷基團，Y+和Y-分別代表陽離子交換劑和陰離子交換劑的平衡離子，A+和A-分別代表溶液中的離子基團。從上面的反應式中可以看出，如果A 離子與離子交換劑的結合力強于Y 離子，或者提高A 離子的濃度，或者通過改變其它一些條件，可以使A 離子將Y 離子從離子交換劑上置換出來。也就是說，在一定條件下，溶液中的某種離子基團可以把平衡離子置換出來，并通過電荷基團結合到固定相上，而平衡離子則進入流動相，這就是離子交換層析的基本置換反應。通過在不同條件下的多次置換反應，就可以對溶液中不同的離子基團進行分離。下面以陰離子交換劑為例簡單介紹離子交換層析的基本分離過程。

陰離子交換劑的電荷基團帶正電，裝柱平衡后，與緩沖溶液中的帶負電的平衡離子結合。待分離溶液中可能有正電基團、負電基團和中性基團。加樣后，負電基團可以與平衡離子進行可逆的置換反應，而結合到離子交換劑上。而正電基團和中性基團則不能與離子交換劑結合，隨流動相流出而被去除。通過選擇合適的洗脫方式和洗脫液，如增加離子強度的梯度洗脫。隨著洗脫液離子強度的增加，洗脫液中的離子可以逐步與結合在離子交換劑上的各種負電基團進行交換，而將各種負電基團置換出來，隨洗脫液流出。與離子交換劑結合力小的負電基團先被置換出來，而與離子交換劑結合力強的需要較高的離子強度才能被置換出來，這樣各種負電基團就會按其與離子交換劑結合力從小到大的順序逐步被洗脫下來，從而達到分離目的。
各種離子與離子交換劑上的電荷基團的結合是由靜電力產生的，是一個可逆的過程。結合的強度與很多因素有關，包括離子交換劑的性質、離子本身的性質、離子強度、pH、溫度、溶劑組成等等。離子交換層析就是利用各種離子本身與離子交換劑結合力的差異，并通過改變離子強度、pH 等條件改變各種離子與離子交換劑的結合力而達到分離的目的。離子交換劑的電荷基團對不同的離子有不同的結合力。一般來講，離子價數越高，結合力越大；價數相同時，原子序數越高，結合力越大。如陽離子交換劑對離子的結合力順序為:。蛋白質等生物大分子通常呈兩性，它們與離子交換劑的結合與它們的性質及pH 有較大關系。以用陽離子交換劑分離蛋白質為例，在一定的pH 條件下，等電點pI < pH 的蛋白帶負電，不能與陽離子交換劑結合；等電點pI > pH 的蛋白帶正電，能與陽離子交換劑結合，一般pI 越大的蛋白與離子交換劑結合力越強。但由于生物樣品的復雜性以及其它因素影響，一般生物大分子與離子交換劑的結合情況較難估計，往往要通過實驗進行摸索。
離子交換劑的種類和性質
(1)離子交換劑的基質
離子交換劑的大分子聚合物基質可以由多種材料制成，聚苯乙烯離子交換劑 (又稱為聚苯乙烯樹脂)是以苯乙烯和二乙烯苯合成的具有多孔網狀結構的聚苯乙烯為基質。聚苯乙烯離子交換劑機械強度大、流速快。但它與水的親和力較小，具有較強的疏水性，容易引起蛋白的變性。故一般常用于分離小分子物質，如無機離子、氨基酸、核苷酸等。以纖維素(Cellulose)、球狀纖維素 (Sephacel)、葡聚
糖(Sephadex)、瓊脂糖(Sepharose)為基質的離子交換劑都與水有較強的親和力，適合于分離蛋白質等大分子物質，葡聚糖離子交換劑一般以Sephadex G－25和G－50為基質，瓊脂糖離子交換劑一般以Sepharose CL－6B 為基質。關于這些離子交換劑的性質可以參閱相應的產品介紹。