以下是離子交換層析柱操作的一般性步驟。此外還需要一些專用步驟以確保離子交換劑在使用時保持穩定。這些步驟如下：’
(1) 加載鹽溶液；
(2) 平衡層析柱；
(3) 蛋白質上樣；
(4) 洗去未結合物質；
(5) 洗脫；
(6) 再生；
(7) 消毒處理。
一般操作條件如表 22.2 所 TK。
因為平街離子必須要徹底地飽和帶電荷的配基, 所以, 鹽溶液的加載是至關重要的。
本步驟通常采用含有 1mol/LNaCU 物質的量濃度為 10~100 mmol/L 的緩沖液進行。
很少使用 KCl。二價離子應避免使用。加載緩沖液的體積應至少為 1 個柱體積，以確保層析柱飽和。需要在線或離線監測電導率方可進一步進行優化。
平衡層析柱時，采用的緩沖液應適宜于蛋白質結合。依據具體情況確定緩沖液的類型、pH 及鹽濃度。本章結合條件部分中已經陳述了關于適宜緩沖液的粗略選擇。平衡過程應至少需要 10 個柱體積緩沖液。采用較大體積的緩沖液是為了獲得更穩定的 pH 環境。因為不同的離子經過層析柱的移動是不一樣的，所以與相同電荷的離子相比, 相反電荷的離子更可能保持不動。這樣，不同的離子便可以依次流過層析柱。為維持中性電荷，pH 要隨之發生改變。該現象的詳細解釋可參見 Pabst 和 Carta(2007) 的報道。尤其是對于弱離子交換配體，相應地需要更大體積的平衡緩沖液才能達到實際所需的 pH 環境。
蛋白質溶液上樣時，應采用與平衡緩沖液一致的 PH 和電導率。通常情況下，不太可能達到該條件，尤其是當初始原料中的離子組成與緩沖液完全不同時，所以在上樣的過程中會發生 pH 轉變。當采用分子篩層析、透析或滲濾對蛋白質溶液脫鹽后，可以達到與緩沖液相同的離子組成，進而獲得相對最穩定的上樣條件。
完成蛋白質溶液上樣后，沖洗掉未結合物質。通常首先嘗試平衡緩沖液。為了在洗脫中獲得的目標蛋白質純度更高，可以采用多步的清洗程序。例如，對于結合緊密的目標蛋白質，可用稍高鹽濃度的平衡緩沖液沖洗。可以向沖洗緩沖液中加入某些化合物，而所加人的這些化合物似乎很具有蛋白質特異性。目前，已有多種方案采用了在沖洗緩沖液中加人某些物質, 它們均具有一定的蛋白質特異性。這些物質可以是尿素、糖類和乙二醇等。
洗脫會受到線性或分步鹽梯度或置換展開的影響。一般最好先采用線性的鹽梯度洗脫，維持梯度約 10 個柱體積。在最簡單的情況下，梯度操作需兩種緩沖液，平衡緩沖液 (bufferA) 和用于加載相反電荷離子所用緩沖液 (bufferB)。大多數情況下，并不需要后半段的梯度，因為多數蛋白質都可以在 150?500nmolI 鹽濃度下從傳統的離子交換劑上洗脫下來。所以，通常最大梯度達到 50%B 足矣。分步洗脫也可通過 bufferA 和 bufferB 實現。也應該意識到也許永遠都不會獲得一種理想的適用于層析柱的分步洗脫。首先，鹽滯留以及 HPLC 的盲端體積都是決定取樣時間的因素; 其次, 因為緩沖液混合器的特性，僅能獲得 S 形曲線 (KaltenbrunnerandJungbauer，1997)。根據分步洗脫中選擇的鹽濃度，蛋白質會隨著鹽峰前端移動或移至鹽峰前端的后方。Yamamoto 等 (1088) 將其命名為 I 型或 n 型洗脫。當濃縮的洗脫物被沖洗出來后，所選擇的鹽濃度必須適于 I 型洗脫。此時的鹽濃度可能要比相應采用線性梯度洗脫所達到的最大鹽濃度高一些。I 型洗脫所需的緩沖液小于 1 個柱體積。
PH 梯度洗脫更難于優化。所以，最好首先根據蛋白質的 pi 找到一種條件—此時蛋白質不與離子交換劑結合。若低于 PI，宜采用陰離子交換劑; 若高于 pi, 宜采用陽離子交換劑。因此必須降低或提高 pH。請記住，離子交換劑本身相當于一種酸或堿，生成 pH 梯度應遵循滴定曲線。要獲得線性的 pH 梯度是十分困難的, 但是采用含有二元醇的硼酸鹽緩沖液可以實現，如甘露醇 (Kaltenbrunneretal.，1993)。第 4 種洗脫方式就是采用手動調節的 pH 梯度進行洗脫。當采用 10 mmol/L 的較低濃度緩沖液洗脫時, 使用鹽可以導致 pH 梯度，這種梯度的形成是因為不同種類鹽移動情況不同。這種手動調節的 pH 梯度，可以用于髙分辨率，另外也有利于蛋白質峰集中（Pabstetal.，2008a;2008b)。這種情況下, 也需要數個柱體積的緩沖液。
對于層析柱的再生，最佳的條件是使用與最初加載鹽溶液相同的緩沖液。這種情況僅在處理相對清潔的原料時才可能出現。可以將兩個步驟合并為一個步驟。尤其是當脂類、內毒素和其他黏性物質承載于離子交換柱時，推薦使用具有腐蝕性的試劑進行再生，優選 Imol/LNaOH。NaOH 的最大使用濃度取決于固定相的耐受性，一般使用 1 個柱體積的量已經足夠，但是對于非常頑固的雜質，應將層析柱浸于 NaOH 溶液中。可將 1 個柱體積 NaOH 泵人層析柱后，停止流動，使 NaOH 滯留于層析柱中數小時。
NaOH 處理同樣起消毒作用。它確實可以減少層析柱中的細菌數量，但不是對層析柱滅菌。要將層析柱進行滅菌處理是十分困難的 (_1111 培匕&此 1&：1(11^1:1；1161：，1994;〗1111§-baueretal.，1994)。裝好的層析柱中存在非常多的盲端孔，滅菌劑只能通過擴散至這些孔內。氧化劑通常與固定相以及設備不相容。對于較小的層析柱，可以采用高壓蒸汽滅菌，并可在無菌條件下連接于系統。一般不必對層析柱進行滅菌處理。
層析柱需要用再生緩沖液仔細洗凈后才能儲存, 必要時還要進行滅菌處理，儲存時用相反電荷離子將層析柱完全飽和。層析柱飽和后，可采用緩沖液進行清洗和儲存，如 20% 的乙醇。實驗室使用時, 推薦向儲存溶液中加人相關的殺菌劑, 通常采用 NaN3。