根據離子交換平衡的一般性原理，很顯然，應在很低的鹽濃度條件下對蛋白質進行上樣 (圖 22.1)。鹽濃度也必須適當地調節，這具體取決于離子交換劑配體的密度。通常推薦的鹽濃度為 1 〇?100_〇 l/L 的緩沖液，其電導率相應為 1?4mS/cm。來源于細菌培養物的一般性原料或細胞培養物，其電導率一般為 15?40mS/cm。這樣，所得到的蛋白質溶液必須進行稀釋或脫鹽處理。稀釋是一種簡單的方法，但僅適用于小規模。更適宜的方法便是進行透析、滲濾或者以分子篩層析進行脫鹽。實驗室規模的處理，建議采用分子篩層析。可以使用離心管簡易柱、預裝柱或自己灌裝的層析柱。最大的上樣體積為層析柱總體積的 1/3。限制性因素是蛋白質溶液的黏度。黏性指進 (viscousfingering) 使樣品擴散加劇，必須減少上樣量。
表面移植的離子交換劑能夠在原料的電導率較高時上樣
(Necinaetal.，1998)。有時，也可以直接用澄清原料上樣。但是該原料的電導率必須較低。經過嫁接的表層可以結合許多離子，平衡狀態會向著允許蛋白質吸附的狀態轉移。必須折中考慮結合容量和原料的預處理進行。作為直接上樣這種簡單處理的交換條件，必須考慮更低的結合容量
(圖 22.3)。現代離子交換劑可以在很高的流速下使用，所以即使是結合容量較低也是可以接受的。
根據蛋白質等電點選擇緩沖液種類。大于等電點，蛋白質帶負電荷，可與陰離子交換劑結合; 而小于等電點時，蛋白質帶正電荷，可與陽離子交換劑結合。實際上，選擇取決于雜質的分布和蛋白質的穩定狀態。具有高等電點的蛋白質，一般宜采用陽離子交換劑進行純化，并且這類蛋白質很容易被純化。圖 22.4 所示為蛋白質等電點的柱狀圖。顯然，弱酸性的蛋白質更難于純化, 因為原料中可能會存在一些 Pl 很接近的雜質, 并且含量可能很高。
蛋白質結合的第 2 條原則, 選擇緩沖液的 pKa 應接近于所選 pH，最多只能有 1 個單位 pH 左右的差別。
第 3 條原則, 緩沖液本身不能與離子交換劑結合，如乙酸鹽或 Tris。所以，不應將乙酸鹽用于陰離子交換層析，Tris 也不能應用于陽離子交換層析。若緩沖液與交換劑結合，可引起 pH 不穩定，且操作條件不具有可重復性。
第 4 條原則，當蛋白質接近離子交換劑表面時，可能會暴露于不同的 PH。對于陽離子交換劑，水和氫離子的結合可引起 1 個單位 PH 的下降; 但對于陰離子交換劑，氫氧根離子的結合可引起 1 個單位 PH 的升高。這一點必須記住，尤其是在純化不穩定性的蛋白質時。
當我們對目標蛋白質 Pl 和其他信息都所知甚少時，需要先進行小規模的探索實驗，采用分批或層析柱，以尋求最佳的結合條件。分批的方式，離子交換劑可填裝于小型測試的離心管或微孔板中; 選擇適宜的緩沖液，改變 PH 或/和鹽濃度，使填料達到平衡狀態，接著加人蛋白質樣品溶液; 先檢測上清液中的蛋白質，之后，再向其中加人鹽，從柱中洗脫蛋白質, 并再次檢測上清液中的蛋白質。采用微孔板的優勢是多次實驗可平行操作。通過離心可以很容易地將固相和液相分開。當前，一些層析材料供應商也提供即買即用的微孔板。
目前，有些供應商也已經設計出相應的小規模預裝柱，它們可以通過注射器或實驗室設備進行操作。采用這類微型柱可以很容易地優化結合條件，同時又不會浪費珍貴的樣品。離子交換劑的結合容量極高，因此優化過程非常消耗原材料。這類小型柱，如來自于
AtolKWeingarten，Germany) 的 MediaScoutMniColumns，其內徑為 5 mm，床高為 10 mm(圖
22.5)。每個均有 0?2 mL
層析吸附劑，需要以合適的密度預裝，并且對于每種樹脂材料均需要分別矯正，這樣也是為了在更大體積層析柱中重復操作。
已經結合的蛋白質的洗脫可以通過以下 4 種方式來實現。
1.線性鹽梯度。
2.分步鹽梯度。
3.pH 梯度。
4.置換展開（displacement development)。
有時可以聯合采用 pH 和鹽梯度進行洗脫，但很難優化，而且經常不能獲得穩定的條件。對于高分辨率的分離，宜采用線性鹽梯度和 pH 梯度洗脫; 分步鹽梯度洗脫則適于濃縮蛋白質。置換層析 (displacementchromatography) 適于分離性質相關的蛋白質，但因其更難于優化，一般很少采用。
蛋白質的滯留窗口一般很小; 在較低的鹽濃度條件下, 蛋白質填料結合緊密，但隨著鹽濃度提高，不能完全保持結合狀態; 圖 22.1 比較了流動相中，和鹽濃度的關系。所以，在離子交換層析中, 一般采用線性梯度，甚至是使用更復雜的分段梯度洗脫。
分辨率 (Rs):
所以，降低顆粒直徑可以從根本上提髙分辨率。一旦采用非孔隙材料，HETP 就僅與顆粒直徑成比例。因此，要達到超高的分辨率，所用材料的顆粒直徑應該在 5 以下，并通常制造成非孔隙顆粒。
隨著梯度范圍增加，峰體積也會隨之增加。分步梯度可以看成為非常陡的線性梯度。
實際上，從來不會用一步洗脫。所以，與線性梯度洗脫相比，采用分步梯度進行蛋白質的洗脫時，鹽濃度應更低。