離子交換柱層析(ionexchangechromatography)分離核苷酸

一、目的：
學習離子交換柱層析法分離核苷酸的原理及方法。
二、原理：
離子交換作用一般指在固相和液相之間發生的可逆的離子交換反應，它可用于分離各種可解離的物質。通常離子交換劑是在一種高分子的不溶性母體上引入若干活性基團。這樣人工會成的離子交換劑具有各種各樣的性能。作為不溶性母體的離分子有樹脂、纖維素、葡聚糖、瓊脂糖或無機聚合物等，引入的活性基團可以是酸性基團，如強酸型的含有磺酸基（—SO3H）、中強酸型的含磷酸基（—PO3H2）、亞磷酸基（—PO2H）、弱酸型的含有羧基（—COOH）或酚羧基（—OH）等。也可以是堿性基團，如強堿型的含季銨[—N+(CH3)3]、弱堿型的含叔胺[—N(CH3)2]、仲胺（—NHCH3）、伯胺（—NH2）等。
在一定條件下，離子交換樹脂吸附的物質數量和在溶液中的物質數量達到平衡時，兩者數量之比叫分配系數（平衡常數）。理想的情況是洗脫曲線和分配系數相符合，待分離的各種物質的分配系數，應有足夠的差別，以Kd表示分配系數：

式中Ms和Ml分別代表單位重量離子交換樹脂和單位體積溶液中溶質的摩爾數。當有A、B兩種溶質進行離子交換柱層析時，吸附在離子交換樹脂上的溶質為高濃度的競爭性離子所交換并被洗脫下來。溶質的遷移速度與分配系數成反比，因此由原點到A、B兩種物質波峰間距離的比值決定于它們分配系數的比值。各波峰的幅度和形狀由柱長及其他因素 （如交換樹脂顆粒的大小形狀、交聯度、流速等）所決定。溶質的分配系數不僅與其電荷有關，也受到它與離子交換樹脂的非極性親和力以及兩者之間的空間關系等因素的影響。

在一定條件下，離子交換樹脂對不同單核苷酸的吸附能力是不同的，因此選擇適當類型的離子交換樹脂，控制吸附及洗脫的條件便可分離各種單核苷酸。

為了增加單核苷酸在離子交換樹脂上的吸附能力，需要：（1）控制條件，使單核苷酸帶上大量相應的電荷。這主要是通過調節pH值，使單核苷酸的一些可解離基團（磷酸基、氨基、烯醇基）解離，四種單核苷酸相對分配系數與pH的關系如圖14-1。（2）減少上柱溶液中除單核苷酸外的其它離子的強度。洗脫時則相反：使被吸附的單核苷酸的相應電荷降低；增加洗脫液中競爭性的離子的強度，必要時提高溫度使離子交換樹脂對單核苷酸的非極性吸引作用減弱。
RNA可被堿水解成2＇-或3＇-核苷酸。可利用陽離子交換樹脂（聚苯乙烯—二乙烯苯，磺酸型）或陰離子交換樹脂（聚苯乙烯—二乙烯苯，季銨堿型）分離單核苷酸。本實驗利用強堿型陰離子交換樹指（強堿型201×8、強堿型201×7、國產717、Dowex1、Amberlite IRA—400或 Zerolit FF等）將各類核苷酸分開，測定核苷酸的紫外吸收光譜的比值：O．D250/O．D260、 O．D280/O．D260、O．D290/O．D260對照標準比值（表14-1），可以確定其為何種核苷酸，同時也能算出RNA中核苷酸的相對摩爾比。
三、試劑及器材：
1．試劑：
①RNA（酵母RNA，商品）
②強堿型陰離子交換樹脂201×8（聚苯乙烯—二乙烯苯、三甲胺季銨堿型，全交換量大于3毫摩爾/克干樹脂，100—200目）：用水浸泡并利用浮選法除去細小顆粒，使用時先用0.5mol·L-1氫氧化鈉溶液浸泡1小時，以除去堿溶性雜質，然后用無離子水洗至中性。再用1N鹽酸浸泡半小時，除去酸溶性雜質，再用無離子水洗至中性，然后用1mol·L-1甲酸鈉溶液浸泡，使樹脂轉變成甲酸型。將樹脂裝入柱內，繼續用1mol·L-1甲酸鈉溶液洗，直到流出液中不含氯離子（用1%硝酸銀溶液檢查）。最后用1mol·L-1甲酸洗，直到260nm處光密度值低于0.020，并用蒸餾水洗至接近中性，即可使用（裝置見圖14—2）。
③1mol·L-1甲酸：取21.4毫升88%甲酸定容至500毫升。
④1mol·L-1甲酸鈉溶液：稱34.15克甲酸鈉用水溶解定容至500毫升。
⑤0.02mol·L-1甲酸：取10毫升1mol·L-1甲酸定容至500毫升。
⑥0.15mol·L-1甲酸：取75毫升1mol·L-1甲酸定容至 500毫升。
⑦0.01mol·L-1甲酸—0.05mol·L-1甲酸鈉溶液（pH4.44）：取5毫升1mol·L-1甲酸、25毫升1mol·L-1甲酸鈉溶液定容至500毫升。

⑧0.1mol·L- 1甲酸—0.1mol·L-1甲酸鈉溶液（pH3.74）：取50毫升1mol·L-1甲酸、50毫升 1mol·L-1甲酸鈉溶液定容至500毫升。
⑨0.3mol·L-1氫氧化鉀溶液：取1.68 克氫氧化鉀用水溶解定容至100毫升。
⑩2mol·L-1過氯酸：取17毫升70—72%過氯酸定容至100毫升。
111mol·L-1鹽酸。
120.5mol·L-1氫氧化鈉溶液。
2．器材：
①玻璃柱（內徑1.1厘米、高20厘米）。
②下口瓶。
③部份收集器。
④紫外分光光度計。
⑤紫外檢測儀。
⑥恒溫水浴鍋。
四、操作步驟：
1．樣品處理：取20毫克酵母RNA，溶于2毫升0.3 mol·L-1氫氧化鉀溶液中，于37℃水解20小時，RNA在堿作用下水解成單核苷酸，水解完成后，用2mol·L-1過氯酸溶液高至pH2以下，以4000轉/分離心10分鐘，取上清液，用 2mol·L-1氫氧化鈉溶液調至pH8，并用紫外分光光度計準確測得含量后待用。
2．離子交換柱的安裝：取內徑1.1 —1.2厘米、高20厘米的玻璃管柱。下端橡皮塞中央插入一玻璃滴管供收集流出液，橡皮塞上蓋以尼龍網和薄絹以防止離子交換樹脂流出9見圖14-2）。
將處理好的強堿型陰離子交換樹脂懸浮液一次倒入玻璃柱內，使樹脂自由沉降至柱下部，用一小片圓濾紙蓋在樹脂面上。緩慢放出液體，使液面降至濾紙片下樹脂面上。（注意在整個操作過程中防止液面低于樹脂，當液面低于樹脂表面時空氣將進入，在樹脂柱內形成氣泡，妨礙層析結果）。經沉積后離子交換樹脂柱床高7—8 厘米。
3．加樣：將RNA水解液小心地用滴管加到離子交換樹脂柱上，待樣品液面降低到濾紙片內時，用50毫升蒸餾水淋洗樹脂柱。堿基、核苷及其他不被陰離子交換樹脂吸附的雜質均被洗出。
4、核苷酸混合物的洗脫：收集蒸餾水洗脫液，在紫外分光光度計上測260nm處光密度，待洗脫液不含紫外吸收物質（光密度值低于0.020）時，可用甲酸及甲酸鈉溶液進行洗脫。
依次用下列洗脫液分段洗脫，500毫升0.02mol·L-1甲酸；500毫升0.15 mol·L-1甲酸；500毫升0.01mol·L-1甲酸-0.05mol·L-1甲酸鈉溶液（pH4.44）；最后用500毫升0.1mol·L-1甲酸-0.1mol·L-1甲酸鈉溶液（pH3.74）。用部份收集器收集流出液，控制流速8毫升/10分，8毫升/管。
5、由層析柱所得各部分洗脫液的分析：以相應濃度的甲酸或甲酸鈉溶液作為空白對照，用紫外光分光光度計測定各管溶液在260nm波長處光密度值，以洗脫液體積（或管數）為橫坐標，光密度值為縱坐標作圖，分析各部分的波峰位置（見圖14-3）。
五、結果分析：
根據各部分核苷酸在不同波長時光密度的比值（O．D250/O．D260、 O．D280/O．D260、O．D290/O．D260），對照標準比值（見表14-1）以及洗脫時相對位置，確定其為何種核苷酸。由洗脫液的體積和它們在紫外部分的光密度值，計算各種核苷酸的含量（各種核苷酸的摩爾消光系數見表5-1）。
表14-1 部分核苷酸的物理常數。