離子交換柱層析分離蛋白原理詳解

　1.離子交換與洗脫
 

　　所謂離子交換，是指溶液中的某一種離子與另一種靠靜電力結合在惰性載體上的離子進行可逆交換的過程，即溶液中的離子結合到載體上而載體上的離子被替換下來。若惰性載體上以共價鍵結合著帶正電荷的活性基團，則可交換陰離子，叫陰離子交換劑；若以共價鍵結合著帶負電荷的活性基團，則可交換陽離子，叫陽離子交換劑。在一定的條件下，混合物中不同蛋白質所帶電荷的性質及電荷多少不同，有的能與特定離子交換劑結合，有的不能結合；能與離子交換劑結合的蛋白質中，結合力的大小也不一定相同，所以，采用適當的洗脫條件，可以對它們進行有效的分離。離子交換過程可以表示如下：
 

　　■一R+Y一+x一→■一R+X一+Y一
 

　　(陰離子交換)■一R—Y++x+→■一R—X++Y+(陽離子交換)
 

　　上式中，■代表惰性載體；R代表惰性載體上的活性基團；Y代表平衡離子(可替換離子)；x代表蛋白質分子。
 

　　樣品進入離子交換柱之前，共價結合于惰性載體上的活性基團大部分處于溶劑化狀態，并吸附著平衡緩沖液中帶相反電荷的離子。蛋白質樣品進入離子交換柱后，由于分子表面一些基團的電荷性質與交換劑上活性基團的電荷性質相反，因而會通過靜電引力結合于交換劑上，并把其原來吸附的平衡離子取代下來。蛋白質是兩性電解質，它與離子交換劑的結合力取決于分子表面能夠與離子交換劑形成靜電鍵的數目，而后者首先與分子所攜帶的電荷的數目有關，其次與蛋白質分子的大小及電荷排列也有一定關系，因為它們與蛋白質分子是否易于在離子交換劑上的適當部位形成靜電鍵有關。總的來說，蛋白質分子與交換劑之間存在三種不同的結合狀態：①蛋白質分子與交換劑之間的靜電鍵數目很多，以致它們同時解離的機率等于零。洗脫時，這部分蛋白質由于結合緊密而停留在柱頂端。②蛋白質分子與交換劑之間的靜電鍵數目相對較少，它們同時解離的機率達到某一有限值(0～1之間)。洗脫時，某一種蛋白質分子的靜電鍵在某一時間里同時解離，隨洗脫液向下移動。③蛋白質分子與交換劑之間的靜電鍵數目極少，完全不與交換劑結合。處于這種狀態的蛋白質分子隨洗脫液的前峰移動，呈現一個高而窄的“穿過峰’’(“不交換峰”)。如果混合物中有幾種蛋白質同時處于這種狀態，那么它們會同時被洗脫下來，達不到分離目的。采用陽離子交換劑時，帶負電荷的蛋白質分子不能結合而呈“穿過峰”洗脫下來。
 

　　蛋白質分子在離子交換劑上的結合狀態是隨著環境條件的變化而改變的。洗脫就是通過改變緩沖液離子強度或/和pH來改變蛋白質與交換劑的結合狀態，降低其與交換劑的結合力，使交換上去的不同蛋白質分子以不同速度洗脫下來，達到分離純化的目的。增加緩沖液的離子強度時，由于洗脫液中高離子強度競爭性離子的存在，與交換劑結合的蛋白質分子被取代下來進入洗脫液中。洗脫液中離子種類不同時，取代能力不一樣。改變緩沖液的pH時，蛋白質分子的解離度降低，電荷減少，從而減弱其與交換劑的結合力。應用陰離子交換劑時要降低pH；應用陽離子交換劑時要升高pH。有時，同時改變兩個方面的條件，有利于分離復雜的蛋白質混合物。在恒定的洗脫條件下，往往難以將復雜的蛋白質混合樣品有效地分離。通常采用不斷改變洗脫條件的方法，即用梯度洗脫的方法來分離蛋白質混合樣品。
 

　　雖然離子交換層析法分離蛋白質時，主要通過離子交換的作用，但實際上也可能存在一些疏水吸附和分子篩作用。
 

　　2.離子交換劑
 

　　人工合成的離子交換劑由高分子的不溶性基質和許多與其共價結合的帶電荷的活性基團組成。由于活性基團的電離性質不同，而有強酸性、強堿性、弱酸性和弱堿性之分。不溶性基質主要有樹脂、纖維素、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和硅膠等。
 

　　離子交換樹脂一般只適合分離小分子物質如氨基酸等，不適合分離蛋白質等大分子物質，一方面是因為大分子不易進入樹脂緊密交聯結構的內部，另一方面是因為交聯聚苯乙烯骨架疏水性很強，用于蛋白質分離時，會出現疏水性的不可逆吸附。此外，離子交換樹脂的機械強度較差，而且樹脂的體積常隨著溶劑離子強度的變化發生溶脹和收縮。離子交換纖維素的種類很多，可分為陰離子交換纖維素和陽離子交換纖維素兩大類。由于這些材料是纖維狀的，大部分活性基團分布在表面，所以，適合于分離蛋白質等生物大分子。二乙基氨乙基纖維素(DEAE一纖維素)和羧甲基纖維素(CM一纖維素)分別是應用得最廣泛的陰離子交換纖維素和陽離子交換纖維素。另外，根據纖維素顆粒的物理結構不同，可分為“纖維型，，和“微晶型”兩大類。‘‘微晶型”因顆粒細、比重大，能制成緊密的柱，交換容量大，分辨率高。
 

　　離子交換葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠具有許多優點：不會引起被分離物質的變性或失活；非特異性吸附很低；交換容量大(為離子交換纖維素的3～4倍)；容易制成微球型，因此裝柱和層析時的流速都較易控制。它的缺點是隨著洗脫液的離子強度和pH的變化，床體積變化大，明顯影響流速；另外，由于它的凝膠性質，有時會把大分子物質排阻在網絡結構之外。
 

　　目前，用于蛋白質和多肽離子交換HPLC的多為以硅膠為載體的離子交換劑。以硅膠為載體的離子交換劑的主要優點是有很好的機械強度，能耐受較高的層析柱壓，可適應廣泛種類的流動相，在含有變性劑、有機溶劑和高離子強度的洗脫液中均能使用，不會發生明顯的溶脹與收縮，而且可以制成各種孔徑5～1000nm的剛性填料。根據硅膠載體上鍵合的活性基團的不同，可分為強酸性、強堿性、弱酸性和弱堿性的離子交換劑。通常用于蛋白質與多肽分離的強酸性陽離子交換劑聯有磺酸基(一S03H)；強堿性陰離子交換劑聯有季胺堿基[一CH2N+(CH3)3]；弱酸性陽離子交換劑聯有羧甲基(一CH2一COO一，CM)；弱堿性陰離子交換劑聯有二乙基氨乙基[一CH2CH2N(CH2CH2)2，DEAE]。強酸性和強堿性離子交換劑的優點是流動相較大范圍內的pH不會改變載體活性基團的帶電性質，因而在酸性、中性和堿性的流動相中均能使用。弱酸性(CM型)的離子交換劑宜在pH>4.0的環境中使用，弱堿性(DEAE型)的離子交換劑宜在pH<9.6的環境中使用。弱酸性和弱堿性離子交換劑由于對
 

　　H+和OH一
 

　　有較大的親和力，為洗脫和再生帶來了方便，對于一些吸附性能較強的蛋白質與多肽樣品采用弱堿性和弱酸性的交換劑，可以在較溫和的條件下，即較低的鹽濃度和較小的pH改變的情況下把樣品洗脫下來。這對于某些蛋白質的活性保持通常是很有意義的。以硅膠為載體的離子交換劑可有不同顆粒孔徑供選擇，大孔徑的填料為相對分子質量Mr大的蛋白質提供更多可交換的基團，使每克交換劑的交換容量增大。一般蛋白質樣品應選擇孔徑為30nm的交換劑，對于相對分子質量Mr150000以上的蛋白質，應當選擇孔徑l00nm的交換劑。
 

　　3.離子交換柱層析條件的選擇
 

　　對于分離一個特定的蛋白質，選擇什么樣的柱子、離子交換劑和流動相等需根據具體情況統籌考慮，主要是根據待分離蛋白質本身的理化性質和生物學性質確定。因此，在采用離子交換層析法進行蛋白質的分離之前，應當對待分離的蛋白質的性質有所了解，如等電點、相對分子質量、疏水性、生物活性及測定方法、溶解性、濃度、發生聚合的可能性、穩定性以及微觀不均一性等。由于多數情況下離子交換柱層析采用梯度洗脫，因而柱子都不需很長。了解樣品的等電點決定選用陽離子還是陰離子交換劑以及流動相的pH；樣品的相對分子質量Mr將決定選用多大孔徑的柱填料；疏水性強的樣品則要求選用疏水吸附較小或親水性載體的交換劑，以防止非特異性疏水吸附；活性測定方法可用來鑒定分離到的樣品及測定回收率；樣品的溶解性在選用流動相的種類時是必須考慮的，并依此決定是否要在流動相中添加促溶劑；根據樣品的穩定性決定層析溫度、流動相pH以及是否要在流動相中添加穩定劑；樣品的濃度和含量是選擇柱體積大小和每次進樣量的依據；對于那些存在微觀不均一的樣品，由于它們在結構和性質上極其相似，所以在分離時要采用分辨率盡可能高的條件(如等梯度洗脫)；對某些樣品還要選用適當的樣品濃度、pH和鹽濃度以防止其發生聚合。
 

　　(1)離子交換劑的選擇在等電點已知的前提下，若所用緩沖液的pH高于等電點，則用陰離子交換劑；反之，若所用緩沖液的pH低于等電點，則用陽離子交換劑；若先確定了所用離子交換劑的類型，那么，就必須對緩沖液的pH作相應的調整。但在實際應用中，為了避免樣品處于過酸或過堿的環境，對于酸性蛋白質和多肽樣品(pI<6)，通常是使其帶有負電荷而采用陰離子交換劑；對于堿性蛋白質和多肽樣品(pI>8)，通常是使其帶有正電荷而采用陽離子交換劑。等電點未知時，可參照電泳分析的結果。在中性和偏堿性條件下電泳時向陽極移動較快的物質，同樣條件下可被陰離子交換劑吸附；向陰極移動或向陽極移動較慢的物質，同樣條件下可被陽離子交換劑吸附。但有時有例外，因為某一物質的層析行為，除與分子的凈電荷有關外，還與它的分子大小、分子結構和電荷排列等有關。對于等電點未知的蛋白質，還可用陰離子交換劑和陽離子交換劑分別在較高pH(如pH8.6)和較低pH(如pH5.5)條件下進行離子交換實驗，觀察交換吸附的情況。如果待分離的物質能被兩種交換劑吸附，則兩種離子交換劑都可用于分離，而且待分離物質與其他成分分離的機會更多。如果都不吸附，則盡量降低樣品和起始緩沖液的鹽濃度，直至幾乎為零。若發現被吸附的物質由于吸附太牢而不易洗脫，則應選用交換當量較小或具有弱解離活性基團的離子交換劑。
 

　　(2)緩沖液的選擇緩沖液離子應不影響被分離物質的活性并不干擾其測定，不影響樣品的溶解度和穩定性。如洗脫液要用280nm波長檢測時，緩沖液內就不能有芳香族化合物；如要用215～225nm波長檢測肽鍵的含量，則不能用含羧基的緩沖液。采用陽離子交換劑時，應選用陰離子型緩沖液，如磷酸、醋酸緩沖液等。采用陰離子交換劑時，應選用陽離子型緩沖液，如Tris、吡啶緩沖液等。
 

　　緩沖液pH的確定首先取決于被分離物質的等電點，采用陽離子交換劑時應低于物質的等電點，采用陰離子交換劑時應高于物質的等電點。同時要結合考慮被分離物質的溶解度、穩定性和離子交換劑的活性基團的PK′。用陰離子交換劑時pH應低于其pK′，用陽離子交換劑時pH應高于其pK′，且應使緩沖液pH介于樣品等電點和pK′之間。
 

　　為了降低鹽離子的競爭，起始緩沖液的濃度要盡可能的低(如0.01mol/L左右)。這就需要選用其pK′接近所需pH的緩沖離子，以使緩沖液具有較強的緩沖能力，避免緩沖離子與離子交換劑作用而引起pH的改變。當確信樣品易被吸附后，可適當提高起始緩沖液的濃度以保證一定的緩沖能力。