離子交換高效液相層析實驗

蛋白質

Tris·Cl NaCl 磷酸鈉緩沖液

交換柱

1.  在使用IEX柱前，依次以序列溶液洗柱去除柱上吸附的蛋白質：10倍柱床的已脫氣水和10倍柱床的高鹽緩沖液，對聚合體IEX柱，洗柱液在8 ~10，對硅膠類柱，洗柱液pH在7~8。

2.  在室溫平衡IEX柱，對4 mm 內徑的柱子，以1.0 ml/min 的流速用0.2 mol/l，pH7.5的Tris·Cl緩沖液和Tris/NaCl緩沖液的50%混 合液洗20 min，然后用10倍柱床以上的0.2 mol/l，pH7.5的Tris·Cl緩沖液沖洗柱子，

3.  用210~220 nm 0.1~1.0 AUFS 監測空白的層析過程：0%~75%Tris/NaCl線性梯度20 min 以上，保持在75%緩沖液5 min，在5  min 以上的時間回復到0%。在下次上樣前，保持0%緩沖液15 min。

4.  注射10 μl 0.2 mol/l Tris·Cl pH7.5進行一次空白樣品的假層析。

5.  在5 000 g 離心IEX蛋白標準或多肽混合物5 min，用以0.2 mol/l Tris·Cl清洗過的HPLC進樣器吸取5 μl 上清，加入樣品環中，并注入柱子，按步驟3開始梯度洗脫。

6.  將每個層析峰收集干不同的聚丙烯管子，用反相HPLC脫鹽，用Speedvac蒸發器除去溶劑。