科研入門基礎實驗之qRTPCR

　　這個假期太長，長的我差點忘了自己之前是做啥課題的，直到和某個zz一起玩公眾號，商量著Ta負責生信領域，我負責實驗部分，各取所長，想想也未嘗不可，那就姑且試試吧。

　　接下來我開始用力回憶當初最先學的實驗是啥？對，是逆轉錄定量 PCR（qRT-PCR）！

　　首先來了解qRT-PCR的流程：提取組織/細胞總RNA，以其中的mRNA為模板，利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA，再進行PCR擴增，通過計算2-ΔΔCt值獲得基因表達。歸根結底，PCR驗證的是基因表達水平。

　　那我們要怎樣開始這個實驗呢？下面假設我后天就要跑一輪PCR。為什么要后天？因為你明天要提RNA 啊，哈哈。

　　我現在有兩個組，對照組和實驗組。首先我們要提取RNA和檢測RNA濃度。

　　我們都習慣在冰上操作，因為可以防止一部分RNA降解。需要注意的是該過程用到的器械需經滅菌消毒且不能交叉使用，EP管、槍頭等也需無菌無核酸酶。佩戴好手套口罩，避免污染。嚴格按照實驗標準操作！

　　然后逆轉錄。常用的是Takara和羅氏逆轉錄試劑盒，在這里以比較實惠的Takara試劑盒為例。將1ugRNA根據如下體系（20ul）和程序逆轉為cDNA。

　　取出cDNA后加入180ulddH2O于-20℃保存待用。逆轉錄是傻瓜式操作，按照說明書做就行，沒有什么特別容易失誤的地方，這里不啰嗦了。

　　最后PCR擴增。

　　取稀釋10倍的cDNA2.5ul，熒光染料SYBER Green5ul，濃度為30uM的上下游引物各0.5ul和DEPC水1.5ul，構成10ul體系進行擴增，每個樣重復3次。參考基因GAPDH或β-actin，假設有目的基因Kiss1、GPR54、GnRH

　　PS：引物一般通過參考文獻或者PrimerBank確定，一定要核對引物來源是否與自己的樣本一致（Human、Mouse、Rat.......）

　　數據導入Graphpad Prism作圖即可看出與正常組相比，目的基因在實驗組的表達情況，再進行統計學分析即可。

　　PCR說簡單也簡單，說難也難，最主要的還是要細心、耐心。idea可以創新，但是實驗方法只有不斷地重復。這里只是粗暴的介紹了整個實驗流程，讓大家稍微有個概念，具體如何操作還是要請教身邊的老師和同門，畢竟實驗樣本誠可貴，可別輕易禍禍了，哈哈。