稀釋法克隆培養

CHO細胞 胰蛋白酶

培養基 吸管 培養皿 血細胞計數器

1. 細胞用胰蛋白酶（胰蛋白酶，0.25 %，1 : 250或相當活性）消化制備單細胞懸液。消化不充分會形成細胞團；過度消化會降低細胞活性。就克隆培養而言細胞呈單個懸浮狀態是基礎。如果是第一次克隆培養新的細胞系，有必要摸索一下消化時間和濃度，以確保能消化成單個懸浮細胞獲得最佳克隆形成率。



2. 在細胞消化期間，給培養皿編號（寫在培養皿底上）、分出每步稀釋用培養基（培養基：Ham F12， 5 % CO₂ 平衡，10 % FBS），也許有必要經過四次稀釋才能將原來單層細胞稀釋至適于克隆培養的濃度。



3. 待細胞變圓，開始脫落時，加入含血清或胰蛋白酶抑制劑的培養基終止消化，分散細胞。

4. 細胞計數，將細胞懸液稀釋至 1×10⁵ /ml，然后再稀釋至每個平皿可產生 50 個集落的濃度。對 CHO 細胞（25cm² CHO 細胞，對數生長晚期）而言，是每 ml 10 個細胞，稀釋步驟是：



(a)將消化后細胞稀釋至 1×10⁵ /ml （約 1 : 10 或 1：20，視培養瓶中細胞數而定）。

(b)取 1×10⁵ 細胞 /ml 200 μl，加至 20 ml （1:100），成為 1×10³ 細胞/ml。

(c)將 1×10³ 細胞 /ml 200 μl，加至 20 ml （1:100），成為 1×10 細胞/ml 。

如果想變換克隆培養條件，如一系列血清濃度、不同的血清或生長因子，此時準備一系列試管，分別在每管中加入 20 μl 1×10³ 細胞 /ml 。

如果是第一次克隆培養測定克隆形成率，選擇試用每毫升中 10、50 、100、200 和 2000 個細胞進行實驗。

5. 接種 3 個平皿，每個平皿中 5 ml 培養基含末次稀釋濃度的細胞。還建議接種每 ml 2000 個細胞的平皿作對照，確認細胞已加人，以防濃度再低時無法形成克隆。

6. 將培養皿放在透明的塑料盒中。

7. 將塑料盒放置于濕潤的 CO₂ 溫箱中或通氣的密閉容器中（2 % ~10 % CO₂）。

8. 靜置培養一周，如果有集落形成，進行以下處理：

(a)克隆形成率分析；進行染色和計數集落。

(b)克隆篩選；單個集落的分離。

如果沒有可見集落，更換培養基后再培養一個星期，若仍沒有集落形成，還可以換培養基后培養第三個星期，再沒有集落出現，則不再有可能出現集落。