試劑、試劑盒 雙蒸水RT-PCR 緩沖液MMLV 逆轉錄酶SUPERaseIN Taq DNA 聚合酶總 RNA 隨機引物dNTP 混合物 基因特異的正向引物基因特異的反向引物
儀器、耗材 PCR 儀 PCR 管
實驗步驟
第一部分：單鏈 cDNA 的合成
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
去除 RNA 酶的雙蒸水
10XRT-PCR 緩沖液（100 mmol/LTris-HCl、pH8.3,500 mmol/LKC1，15 mmol/LMgCl2)
2. 酶和酶緩沖液
MMLV 逆轉錄酶（100~200U/ul)
SUPERaseIN(20U/ul,Ambion)
3. 核酸和寡核苷酸
dNTP 混合物（10 mmol/L, 包含所有四種 dNTP)
隨機引物（50umol/L)
總 RNA(1~5ug)
4. 放射性復合物
競爭性 RNA 轉錄本，109 拷貝（見方案 4)
5. 實驗器材
薄壁的 PCR 管
二、方法
1. 在冰上向薄壁的 PCR 管中加 2ul 的 50umol/L 隨機引物，一管用于 RNA 樣品，一管用于競爭性 RNA 轉錄本。
2. 加 1~5ug 總 RNA 到樣品管（最大體積為 10ul)。
3. 加 109 個拷貝的競爭性 RNA 轉錄本到相應管中（最大體積為 10ul)。
4. 在每管中加入 4ul 的10mmol/LdNTP 混合物。
5. 用去除 RNA 酶的雙蒸水把體積增加到 16ul。
6.70°C 加熱 10min，變性二級結構，然后立即放在冰上。
7. 加 2ul 的 10XRT-PCR 緩沖液。
8. 加 1ul 的 20U/ulSUPERaseIN。
9. 加 1ul 的 100~200U/ulMMLV 逆轉錄酶。
10.42°C 孵育 lh。
11.95°C 加熱 10min 使逆轉錄躊失活。
12. 繼續進行擴增反應，或-20°C 儲存。
第二部分：PCR 擴增
這一方案中 PCR 擴增的宗旨與相對 RT-PCR 中描繪的相同（見方案 1)。方案設計包括6 個反應及額外的 10% 份額。這對于一個樣品用 4 個稀釋濃度的競爭子、1 個無競爭子的對照和 1 個無模板的對照是足夠量的。
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
去除 RNA 酶的雙蒸水
10XRT-PCR 緩沖液（100 mmol/LTris-HCl、pH8.3，500 mmol/LKC1，15 mmol/LMgCl2)
2. 酶和酶緩沖液
TaqDNA 聚合酶（5U/pl)
3. 核酸和寡核苷酸
dNTP 混合物（10 mmol/L，包含所有四種 dNTP)
基因特異的正向引物（5umol/L)
基因特異的反向引物（5umol/L)
來自上述反轉錄反應的 cDNA
4. 放射性復合物
競爭性 RNA 反轉錄反應物（未稀釋=5X107 拷貝/ul)
薄壁的 PCR 管
6. 專用儀器
可編程的 PCR 儀
二、方法
1.準備 PCR 反應混合物。
10XRT-PCR 緩沖液 35ul
10 mmol/LdNTP 混合物 28ul
5umol/L 基因特異的正向引物 14ul
5umol/L 基因特異的反向引物 14ul
5U/ulTaq DNA 聚合酶 1.75ul
去除 RNA 酶的雙蒸水 236.25ul
2.平均在每個 PCR 管中加入 47ulPCR 反應混合物，共 6 管，分別標記 1~6, 在冰上操作。
3.加 2ul 準備好的模板 cDNA 到 1~5 號管中（見單鏈 cDNA 的合成）。
4.梯度稀釋的反轉錄反應包含的競爭性 RNA 轉錄本如下。
未稀釋：1ul 反轉錄混合物=5X107 拷貝/ul
稀釋 102 倍：加 1ul 反轉錄混合物到 99ul 的 TE 緩沖液中=5X105 拷貝/ul
稀釋 104 倍：加 1ul 的稀釋 102 倍反轉錄混合物到 99ul 的 TE 緩沖液中=5X103/ul
稀釋 106 倍：加 lul 的稀釋 104 倍反轉錄混合物到 99ul 的 TE 緩沖液中=5X101/ul
5.加 1ul 未稀釋的競爭子到 1 號管中，對應 5X107 拷貝/ul。
6.加 1ul 稀釋 102 的競爭子到 2 號管中，對應 5X105 拷貝/ul。
7.加 1ul 稀釋 104 的競爭子到 3 號管中，對應 5X103 拷貝/ul。
8.加 1ul 稀釋 106的競爭子到 4 號管中，對應 5Xl01 拷貝/ul。
9.加 1ul 去除 RNA 酶的雙蒸水到 5 號管中，作為無競爭子對照。
10.加 3ul 去除 RNA 酶的雙蒸水到 6 號管中，作為無模板對照。
11.在適當的配有熱蓋的 PCR 儀（例如 GeneAmpPCRSystem9700，AppliedBioSystems) 上運行 PCR 擴增。擴增程序如下。
94°C 30s
退火溫度 30s
72°C 30s
30 個循環
12.在含有 1ul/ml 溴化乙錠的 2%~2.5% 的瓊脂糖凝膠上檢驗實驗結果。每個反應上樣 5ul，結果以轉錄本的量和拷貝數來表示。由于設計時競爭子具有與目的基因同樣的反應動力學，可以與目的基因共同擴增，而且在每個反應中樣品和競爭子 PCR 產物的量可以直接比較。競爭子獲得的 PCR 產物的強度與來自于內源 RNA 轉錄本的擴增相一致，同等強度代表 RNA 樣品中存在的內源信息。競爭性定量 RT-PCR 實驗的例子如圖 13-6。
13. 為了對影響競爭子和外源轉錄本的反轉錄效率的變量進行控制，要做一個最終的RT-PCR 實驗，在這個實驗中樣品 RNA 和競爭子 RNA 在同一個管中被反轉錄。使用的競爭子 RNA 的量要接近于在初始 RT-PCR 實驗中所提出的量，如前所述做反轉錄、擴增。如前所述，與內源信息產生同樣信號強度的競爭子 RNA 的量代表了樣品中內源信息的量。