第二代測序原理的詳細解析！

　　2005年，羅氏推出了第一款二代測序儀羅氏454，生命科學開始進入高通量測序時代。后續隨著Illumina系列測序平臺的推出，極大降低了二代測序的價格，推動了高通量測序在生命科學各個研究領域的普及。目前，高通量測序已經成為一種常規研究方法，大量科研工作中均會用到。然而，為什么二代測序能實現高通量？為什么二代測序讀長如此之短？為什么reads末端測序質量會降低？應該如何選擇測序讀長與打斷片段的長度？想要回答這些問題，都需要詳細了解二代測序的基本原理。本篇文章以典型的Illumina雙末端測序為例，詳細解析二代測序的原理。

　　第二代測序（Next-generation sequencing，NGS）又稱為高通量測序（High-throughput sequencing），是基于PCR和基因芯片發展而來的DNA測序技術。我們都知道一代測序為合成終止測序，而二代測序開創性的引入了可逆終止末端，從而實現邊合成邊測序（Sequencing by Synthesis）。二代測序在DNA復制過程中通過捕捉新添加的堿基所攜帶的特殊標記（一般為熒光分子標記）來確定DNA的序列，現有的技術平臺主要包括Roche的454 FLX、Illumina的Miseq/Hiseq等。由于在二代測序中，單個DNA分子必須擴增成由相同DNA組成的基因簇，然后進行同步復制，來增強熒光信號強度從而讀出DNA序列；而隨著讀長增長，基因簇復制的協同性降低，導致堿基測序質量下降，這嚴格限制了二代測序的讀長（不超過500bp），因此，二代測序具有通量高、讀長短的特點。二代測序適合擴增子測序（例如16S、18S、ITS的可變區），而基因組、宏基因組DNA則需要使用鳥槍法（Shotgun method）打斷成小片段，測序完畢后再使用生物信息學方法進行拼接。