pH梯度的組成方式有二種，一種是人工pH梯度，由于其不穩定，重復性差，現已不再使用。另一種是天然pH梯度。天然pH梯度的建立是在水平板或電泳管正負極間引入等電點彼此接近的一系列兩性電解質的混合物，在正極端引入酸液，如硫酸、磷酸或醋酸等，在負極端引入堿液，如氫氧化鈉、氨水等。電泳開始前兩性電解質的混合物pH為一均值，即各段介質中的pH相等，用pH0表示。電泳開始后，混合物中pI最低的分子，帶負電荷最多，pI1為其等電點，向正極移動速度最快，當移動到正極附近的酸液界面時，pH突然下降，甚至接近或稍低于PI1，這一分子不再向前移動而停留在此區域內。由于兩性電解質具有一定的緩沖能力，使其周圍一定的區域內介質的pH保持在它的等電點范圍。pH稍高的第二種兩性電解質，其等電點為pI2，也移向正極，由于pI2>pI1，因此定位于第一種兩性電解質之后，這樣，經過一定時間后，具有不同等電點的兩性電解質按各自的等電點依次排列，形成了從正極到負極等電點遞增，由低到高的線性pH梯度。