流式細胞儀數據的獲取必須是在儀器性能的校準均合格的基礎上進行。由于流式細胞儀是基于對散射光信號和熒光信號進行分析的儀器，因此，儀器散射光和熒光信號的光電倍增管電壓、增益、顏色補償等參數的設定直接影響結果。同型對照的設定尤為重要。同型對照是指與單抗種宿來源相同、亞型相同、標記熒光素相同的未免疫動物的免疫球蛋白。同時考慮濃度、F/P值盡量相同，這樣陽性閾值的界定才比較準確，特別是對于弱表達抗原陽性率的測定。而DNA倍體分析中參照物的設定非常重要，一般雞紅細胞作為內參照物。為了結果的可靠性，對獲取的細胞量至少應在10000-20000個。但不同的實驗目的對于獲取的細胞量要求一般是不一樣的，如DNA倍體分析，至少應獲取10000個細胞；微小殘留病灶（MRD）的檢測，要求達到10-4數量級水平，則應至少分析100000個細胞干細胞移植中CD34的檢測，應至少獲取100個CD34陽性細胞或75000個有核細胞。
對于獲取的數據，應保存在listmode文件中，便于分析。設門（gating）對于流式數據分析至關重要。設門實際就是確定分析區域。在DNA倍體分析中，設門實際就是圈定單個細胞，排除粘連細胞。對于細胞成分單一的標本（如培養細胞），設門比較簡單。但對于成分復雜的標本（如骨髓）而言，準確的設門就不那么簡單。前向散射光（FS）與側向散射光（SS）設門干擾因素較多，目前，越來越多的被免疫標記物加散射光設門所取代。如，CD45/SS設門已成為白血病/淋巴瘤免疫分型、CD34檢測、MRD監測最佳的設門方法；CD19/SS設門對于成熟B淋系增生性疾病分析非常適用。