簡并寡核苷酸引物PCR(DOPPCR)

顯微切割或流式分選的染色體經過PCR擴增制備整條染色體的DNA，被認為是對某條染色體全部涂染的高質量探針的首選途徑。對于單個染色體、多色FISH(M-FISH)或光譜核型分析中所有24條染色體的涂染均是此種情況。下面提供的操作程序是簡并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)最原始操作程序的修改版本，適于用SpectrumOrange?dUTP或SpectrumGreen?dUTP擴增染色體DNA。此操作程序稍做修改或不做修改，就可以用各種其他的標記dUTP擴增染色體DNA。

反應涉及的寡核苷酸，其5'端有XhoⅠ限制性內切核酸酶酶切位點，3'端有確定的寡聚六核苷酸序列和中間有一系列簡并核苷酸序列（所有四核苷酸的隨機混合）。從理論上計算表明在整個基因組中每4kb就有一個這種確定的六核苷酸序列。在合適條件下，用此序列作為引物的擴增可繞過特定的3'序列，也許通過一個或更多的簡并核苷酸進行退火提髙穩定性，5'端特定序列使得該引物在較高的溫度退火。在實際應用中，DOP-PCR操作程序開始的幾個循環中用低退火溫度（低保真PCR)，然后進行多個循環的高退火溫度（高保真PCR)，產生隨機擴增的DNA混合物。流式分選的染色體一般通過兩輪DOP-PCR的擴增，其產物在熒光標記的三磷酸核苷酸存在的條件下進行第三輪擴增而得到標記。雖然缺口平移方法也可以用于標記進行染色體分析的探針，但獲得高質量探針一般不需該步驟。

流式細胞儀分選的染色體（每個PCR反應需500?1000條染色體)

10×PCR緩沖液PCR分析溶液PCR標記緩沖液引物Taq聚合酶

PCR儀

一般來說，流式分選的染色體進行重懸并在PCR分析緩沖液中擴增，PCR條件為：95°C、5min，然后9個循環的94°C、1min，30°C、1.5min，72°C、3min，升降溫時間為2min、5s;接下來進行35個循環的94°C、15s，62°C、15s，72°C、15s(見注釋8?10);然后進行單獨72°C延伸10min，最后保存在4°C。上述PCR產物在100μL體系中按照同一PCR條件進行再擴增。10μL擴增產物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，形成大小為300?1000bp的成片條帶。DNA的最終產量在1.5?3.0μg。上述PCR產物在PCR標記緩沖液中，用擴增DNA的PCR條件進行標記。1?21μL的標記DNA不用純化就可直接用于雜交。

1.在PCR操作中污染是非常嚴重的問題。為了避免PCR反應的污染，盡量用最好質量的試劑，這些試劑僅用于PCR。所有溶液最好分裝，并凍存于-20℃備用。同時，用防氣溶膠的管尖移液以減少交叉感染。指定實驗室中一個區域專門用于PCR操作。如果可能，DNA樣品的制備在單獨實驗室進行。另外，每次PCR實驗操作選擇合適的陰性對照（無靶序列）是非常重要的。

2.特定靶序列的PCR需要對Taq酶進行滴度測定。過多的酶可導致非特異性背景。

3.改變循環數目以確定獲得最好信噪比的合適循環數。

4.大分子質量DNA(電泳時可見從膠孔到約2.0kb大小的成片條帶）的存在表明標記的探針不合適。這種探針可導致非特異性、非細胞成分的髙背景，有時可以通過超聲破碎降低背景。如注釋9中提到的Taq酶滴定方式，確定合適的PCR循環數。