層析法利用混合物中各組分的物理化學性質間的差異（溶解度、分子極性、分子大小、分子形狀、吸附能力、分子親合力等），使各組分在支持物上集中分布在不同區域，借此將各組分分離。
層析法進行時有兩個相，一個相稱為固定相，另一相稱為流動相。由于各組分所受固定相的阻力和流動相的推力影響不同，各組分移動速度也各異，從而使各組分得到分離。
層析技術與待分離混合物中各組分的理化性質（分子自然形狀、大小、獲電狀態、溶解度與選擇性吸附劑或載體物的吸附能力，分配系數、酸堿環境、溫度、極性以及分子的親和能力等）有著直接關系。除此，任何層析技術，均具有兩相條件，造成流動相對固定相作單向相對運動。這種流動相推動樣品中各組分通過固定相向前遷移，其運動速率與兩相物質和被分離物質狀態有關。由于被分離物各組分中的理化性質不同，對不同的兩組或兩組以上組分，具有不同的作用力，通過吸附一解吸，或離子交換、分子篩效應、靜電引力，免疫特異性吸附等，造成各組間生物分子分離、遷移距離不等，最終達到被測物的分離、純化的目的。這一技術的應用，不但能分離有機化合物，還能分離無機物，更主要的是適合于分離分析生物高分子物質，其分離范圍廣，適用性強。化學性穩定、靈敏度高，既可純化又可制備，條件簡便。