抗結核片有廣譜抗菌作用，對結核桿菌、麻風桿菌和革蘭陽性球菌特別是耐藥性金葡菌都有很強的抗菌作用，對革蘭陰性菌、某些病毒和沙眼衣原體也有抑制作用。對結核桿菌的最低抑菌濃度平均為0.018mg/L，口服治療量后血藥濃度為此濃度的100倍，故可發揮殺菌作用。抗
結核作用與異煙肼相近，而較鏈霉素強。結核桿菌對利福平易產生耐藥性，故不宜單用。與異煙肼、乙胺丁醇等合用有協同作用，并能延緩耐藥性的產生。抗結核片的抗菌機制是特異性地抑制細菌依賴于DNA的RNA多聚酶，阻礙mRNA合成，對動物細胞的RNA多聚酶則無影響。