根據典型病史、遺傳方式、陽性家族史、肌肉萎縮無力分布特點，結合血清肌酶升高，肌電圖呈肌源性改變，肌肉活檢病理為肌營養不良或肌源性改變的特征，多數肌營養不良癥可獲得臨床診斷。進一步確診或具體分型診斷需要用抗缺陷蛋白的特異性抗體進行肌肉組織免疫組化染色以及基因分析。
(1) 血清肌酶檢驗：包括肌酸激酶、乳酸脫氫酶、肌酸激酶同工酶、天冬氨酸氨基轉移酶和丙氨酸氨基轉移酶等。DMD時肌酸激酶升高顯著，可達正常值的20～100倍以上。BMD時可升高5～20倍。在疾病不同階段，肌酶水平也有變化。早期升高顯著，當肌肉萎縮嚴重達疾病晚期時肌酶水平逐漸下降。LGMD和遠端型肌病患者肌酶輕到中度升高，FSHD患者肌酶可正常或輕度增高。
(2) 肌電圖：肌電圖呈現典型肌源性改變的特征，輕收縮時運動單位電位時限縮短，波幅降低，最大用力收縮時為電位密集的病理干擾相。在疾病不同階段，肌電圖改變也可有變化。
(3) 肌肉活檢病理：肌營養不良肌肉組織病理表現為肌纖維變性、壞死，可見不透明纖維和肌纖維再生，可見肌纖維肥大，間質中結締組織和脂肪組織增生。DMD不同階段病理改變也不相同，在疾病晚期以結締組織增生為主，在大量結締組織中可殘存少數變性肌纖維。BMD的病理改變較DMD輕。LGMD可出現可出現分裂纖維和渦狀纖維。采用針對缺陷蛋白的特異性抗體進行肌肉組織的免疫組化染色，是目前鑒別各型肌營養不良癥的主要方法。
(4) 基因檢查：部分肌營養不良癥可采用基因檢查獲得診斷，主要是DMD和BMD患者，有助于基因攜帶者檢出和產前診斷。運用多重PCR技術，能檢測dystrophin基因缺失和基因重復，對于非缺失型的突變不能檢出，對點突變可采用mRNA分析進行檢測。應用p13E-11標記的4q35EcoR1/Bln1雙重消化可檢測限制性片段長度，對FSHD進行基因診斷。對于LGMD來說，由于涉及的基因多，每種亞型的基因突變缺乏熱點，因此直接的基因檢查比較困難，應先根據免疫組織化學結果初步分型然后再進行DNA檢測。
(5) 其他檢查：胸片、心電圖和超聲心動圖檢查可了解患者心臟受累情況。骨和關節X線可了解骨關節畸形。肺功能檢查有助于判斷疾病的嚴重程度。