N-乙基西索米星屬氨基糖苷類藥。其作用機制是通過作用于細菌體內的核糖體，抑制細菌蛋白質合成，并破壞細菌細胞膜的完整性，致使細菌細胞膜破裂、細胞死亡。N-乙基西索米星對大腸桿菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌、枸櫞酸桿菌、莢膜桿菌屬、腸桿菌屬、肺炎桿菌等革蘭陰性菌具有很強的抗菌活性；對革蘭陽性菌如金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌也有一定活性，但對鏈球菌、腸球菌、肺炎球菌抗菌作用較弱。N-乙基西索米星抗菌譜與慶大霉霉素近似。
