酸性磷酸酯酶動力學性質分析
米氏常數（Km）和最大反應速度（Vm）的測定
[原理]
在溫度、pH及酶濃度恒定的條件下，底物濃度對酶促反應的速度有很大的影響。在底物濃度很低時，酶促反應的速度（v）隨底物濃度的增加而迅速增加；隨著底物濃度的繼續增加，反應速度的增加開始減慢；當底物濃度增加到某種程度時，反應速度達到一個極限值（Vmax）。
底物濃度與反應速度的這種關系可用Michaelis-Menten方程式表示：
式中
v——反應速度；
Km——米氏常數；
Vmax——酶反應最大速度；
[S] ——底物濃度。
從米氏方程式可見：米氏常數Km等于反應速度達到最大反應速度一半時的底物濃度，米氏常數的單位就是濃度單位(mol/L或mmol/L)。
在酶學分析中，Km是酶的一個基本特征常數，它包含著酶與底物結合和解離的性質。Km與底物濃度、酶濃度無關，與pH、溫度、離子強度等因素有關。對于每一個酶促反應，在一定條件下都有其特定的Km值，因此可用于鑒別酶。
測定Km、Vmax，一般用作圖法求得。作圖法有很多，最常用的是Linewaver-Burk作圖法，該法是根據米氏方程的倒數形式，以1/v對1/[S]作圖，可得到一條直線。直線在橫軸上的截距為 -1/Km，縱截距為1/Vmax，可求出Km與Vmax。
[方法和步驟]
1、制作標準曲線
取9支 試管 ，按0～8編號。
1～8號管分別加入0.1至0.8mL酚標準應用液，并用蒸餾水將各管體積補充至1.0mL，0號管中加入1.0mL蒸餾水。各管各加1mol/L碳酸鈉溶液2.0mL和Folin-酚稀溶液0.5mL，搖勻后，35℃保溫顯色10分鐘。以0號管作空白，在可見光分光光度計680nm波長處讀取各管的吸光度A 680 。
整個操作過程見下表：
管號 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 0 |
酚含量/μmol | 0.04 | 0.08 | 0.12 | 0.16 | 0.20 | 0.24 | 0.28 | 0.32 | - |
0.4mmol/L酚標準應用液/mL | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0.5 | 0.6 | 0.7 | 0.8 | - |
蒸餾水/ mL | 0.9 | 0.8 | 0.7 | 0.6 | 0.5 | 0.4 | 0.3 | 0.2 | 1.0 |
1mol/L碳酸鈉溶液/ mL | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
Folin-酚稀溶液/mL | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
以酚含量(μmol)為橫座標，以A 680 為縱坐標，繪制標準曲線。
2、測定Km、Vmax
取 試管 7支，按照0～6編號，空白管為0號。各管按下表加入不同體積5mmol/L磷酸苯二鈉溶液(pH5.6)，并分別補充0.2mol/L pH5.6乙酸鹽緩沖液至0.5mL。35℃預熱2min后，逐管記時加入酸性磷酸酯酶酶液0.5mL，搖勻，精確反應15min。各管反應時間到達后立即加入1mol/L碳酸鈉溶液2mL，搖勻，再加入Folin-酚稀溶掖0.5 mL，35℃保溫顯色l 0min。0號管內最后加入0.5 mL酶液，其它操作與上述各管相同。冷卻后以0號管作空白，在可見光型 分光光度計 680nm波長處讀取各管的吸光度A 680 。
在溫度、pH及酶濃度恒定的條件下，底物濃度對酶促反應的速度有很大的影響。在底物濃度很低時，酶促反應的速度（v）隨底物濃度的增加而迅速增加；隨著底物濃度的繼續增加，反應速度的增加開始減慢；當底物濃度增加到某種程度時，反應速度達到一個極限值（Vmax）。
管號 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 0 |
磷酸苯二鈉終濃度/ mmol×L -1 | 0.5 | 0.75 | 1.0 | 1.25 | 1.50 | 2.50 | |
5 mmol/L磷酸苯二鈉/ mL | 0.10 | 0.15 | 0.20 | 0.25 | 0.30 | 0.50 | 0.5 |
0.2mmol/L乙酸鹽 緩沖液 / mL | 0.4 | 0.35 | 0.30 | 0.25 | 0.20 | 0 | 0 |
稀釋酶液/ mL | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 (最后加入) |
1mol/L碳酸鈉溶液/ mL | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
Folin-酚稀溶液/mL | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
A 680 |
[結果與計算]
1、從酚標準曲線上查出各管A 680 相當的酚含量，計算各種底物濃度下的反應初速度v。
2、以1/v為縱坐標，1/[S]為橫坐標作圖，求出Km和Vmax。